蔡玉穎，劉志順，王 順，王奇峰，談太鵬，蔣 花

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 針灸科，北京 100053；2.黑龍江省中醫(yī)研究院 針灸科，黑龍江 哈爾濱 150036）

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的主要病理機制，腦血流中斷和再灌注使腦細胞產(chǎn)生損傷是一個快速的級聯(lián)反應(yīng)，病理級聯(lián)反應(yīng)的惡性循環(huán)導(dǎo)致機體處于持續(xù)的惡性應(yīng)激刺激狀態(tài)，從而引起神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫（NEI）網(wǎng)絡(luò)功能的紊亂，繼而加重腦缺血再灌注損傷。神經(jīng)遞質(zhì)的紊亂是腦缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)，其中腦啡肽中 β-EP和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)。本實驗采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測下丘腦組織中 β-EP、Glu蛋白表達水平，從神經(jīng)遞質(zhì)角度研究電針經(jīng)穴通過調(diào)控下丘腦中β-EP、Glu蛋白表達水平而發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷后腦保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

免疫組化 β-EP、Glu試劑盒，武漢博士德公司；免疫組化二抗試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)公司；研究用生物顯微鏡，日本 OLYMPUS BX60；輪轉(zhuǎn)式組織切片機，德國Leica 2135型；生物組織包埋機，天津愛華BMJ-1型；Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，廈門麥克奧迪；KWD-808Ⅱ型電針儀，常州市武進長城醫(yī)療器械有限公司。

1.2 動物與分組

健康Wistar雄性大鼠，體重 250g～300g，由長春高新醫(yī)學(xué)動物實驗研究中心提供，動物許可證號SCKY-（吉）2003-0004。大鼠按體重隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、電針非經(jīng)穴組（模型 +電針非經(jīng)穴）和電針經(jīng)穴組（模型+電針經(jīng)穴）5組，每組均分為1d、3d、7d 3個時間點，每時間點6只動物。模型判斷標(biāo)準(zhǔn)按照 Zea-Longa［1］報道的4分制進行，評分在1～3分的大鼠認為模型制作成功，排除實驗中死亡者與造模后不符合模型判斷標(biāo)準(zhǔn)者。

1.3 造模方法

采用改良線栓法［1］制備大鼠 MCAO再灌注模型。大鼠稱重，按300mg/kg腹腔注射10％水合氯醛麻醉。仰臥位固定于手術(shù)臺上，備皮消毒后沿頸部正中切開皮膚，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），結(jié)扎 CCA下端，同時結(jié)扎右側(cè)ECA，然后用動脈夾夾住 ICA遠端以暫時止血，在CCA近頸內(nèi)、頸外動脈分叉處剪一小口，將尼龍線插入ICA，稍稍結(jié)扎CCA分叉插線處，然后撤掉ICA遠端動脈夾，將尼龍線順勢緩緩送入，越過翼腭動脈直至顱內(nèi)大腦前動脈近端，深度為18mm～20mm，以阻斷該側(cè)大腦中動脈血流導(dǎo)致腦缺血。2 h后輕輕提拉所留線頭實現(xiàn)大腦中動脈再灌注則造模完成。假手術(shù)組除不插入線栓外，其余同模型組。

1.4 治療方法

1.4.1 選穴 大鼠針灸穴位定位參考《實驗針灸學(xué)》［2］附錄中常用實驗動物的針灸穴位。曲池穴位于橈骨近端關(guān)節(jié)外側(cè)前方凹陷中；足三里穴位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5mm；非曲池穴位于平行曲池外側(cè)旁開5mm；非足三里穴位于平行足三里外側(cè)旁開5mm。

1.4.2 操作方法 電針經(jīng)穴組：大鼠取俯臥位固定，注意固定鼠尾。定穴消毒后，針刺雙側(cè)曲池、足三里穴，調(diào)整好刺激參數(shù)，連接刺激電極，針柄接電針治療儀，一極接曲池穴，另一極接同側(cè)足三里穴，疏密波，頻率2/30Hz，電流強度1mA，大鼠以觸須、耳朵微動為度。于再灌注6h后開始針刺，每天針刺1次，連續(xù)針刺，每次30min，取材前2h再針刺1次。

電針非經(jīng)穴組：針刺雙側(cè)非曲池、非足三里穴，其他治療同電針經(jīng)穴組。正常組、假手術(shù)組和模型組動物只捆綁固定，不針刺。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 標(biāo)本采集與處理 實驗結(jié)束后，按300mg/kg腹腔注射10％水合氯醛麻醉，從心尖部沿左心室插入灌注管至升主動脈入口，剪開右心耳，先用0.9％生理鹽水150ml快速灌注，再用預(yù)冷的4％多聚甲醛（0.1mol/L磷酸鹽緩沖液配制）200ml～300ml灌注，先快后慢，直至鼠尾翹起，身體逐漸僵硬，顏色變白為止。迅速斷頭取腦，取下丘腦放入4％多聚甲醛固定液中固定過夜，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、石蠟切片，待測。

1.5.2 指標(biāo)檢測方法 采用免疫組織化學(xué)法檢測下丘腦β-EP、Glu蛋白表達水平，步驟如下：（1）組織切片脫蠟至水；（2）EDTA微波修復(fù)抗原；（3）3％H2O2去離子水孵育10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗 2min×3次；（4）滴加一抗（1∶50），4℃過夜，PBS沖洗2min×3次；（5）生物素化兔抗 IgG，37℃孵育30min，PBS沖洗 2min×3次；（6）DAB顯色，顯微鏡下控制顯色程度；（7）蒸餾水充分沖洗；（8）蘇木素復(fù)染、脫水、透明；（9）中性樹脂封片。

1.5.3 結(jié)果判定與分析方法 陽性表達細胞胞漿呈棕黃色，陰性細胞核呈藍色。采用 Motic Med6.0圖像分析系統(tǒng)，每組每時間點各選6張切片，每張切片在400倍下隨機選取6個非重疊視野，按照512×512像素分布攝入圖像并保存病理圖像分析系統(tǒng)內(nèi)，選擇免疫組化分析模塊，通過灰度調(diào)節(jié)區(qū)分視野內(nèi)陽性信號面積，計算陽性目標(biāo)總面積與統(tǒng)計場總面積比值，取陽性目標(biāo)面密度平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 電針經(jīng)穴對腦缺血再灌注損傷大鼠 β-EP蛋白表達的影響

表1、圖1～圖13顯示，正常組與假手術(shù)組各時間點β-EP蛋白表達均無顯著性差異（P＞0.05）；模型組缺血再灌注ld，β-EP蛋白表達明顯升高，持續(xù)7d仍維持較高水平，與同時間點正常組、假手術(shù)組比較具有顯著性差異（P＜0.01）；電針經(jīng)穴組與同時間點模型組、電針非經(jīng)穴組比較，β-EP蛋白表達明顯增高（P＜0.01，P＜0.05）。

表1 各組腦缺血再灌注損傷大鼠β-EP蛋白表達的比較±s）

表1 各組腦缺血再灌注損傷大鼠β-EP蛋白表達的比較±s）

注：與同時間點正常組比較：＊＊P＜0.01；與同時間點假手術(shù)組比較：△△P＜0.01；與同時間點電針經(jīng)穴組比較：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組β-EP 1d 3d 7d正 常 組 6 0.0246±0.0043 0.0253±0.0041 0.0245±0.0055別n蛋白陽性目標(biāo)面密度假 手 術(shù) 組 6 0.0266±0.0059 0.0295±0.0042 0.0281±0.0047模 型 組 6 0.1088 ±0.0070＊＊△△▲▲ 0.1068 ±0.0155＊＊△△▲▲ 0.0909 ±0.0123＊＊△△▲▲電針非經(jīng)穴組 6 0.0841±0.0101▲▲ 0.0814±0.0129▲ 0.0716±0.0071▲電針經(jīng)穴組 6 0.0552±0.0058 0.0573±0.0063 0.0569±0.0073

圖1 正常組（×400）

圖2 假手術(shù)組1d（×400）

圖3 假手術(shù)組3d（×400）

圖4 假手術(shù)組7d（×400）

圖5 模型組1d（×400）

圖6 模型組3d（×400）

圖7 模型組7d（×400）

圖8 電針非經(jīng)穴組 1d（×400）

圖9 電針非經(jīng)穴組 3d（×400）

圖10 電針非經(jīng)穴組 7d（×400）

圖11 電針經(jīng)穴組1d（×400）

圖12 電針經(jīng)穴組3d（×400）

圖13 電針經(jīng)穴組7d（×400）

2.2 電針經(jīng)穴對腦缺血再灌注損傷大鼠Glu蛋白表達的影響

表2、圖14～26顯示，正常組與假手術(shù)組各時間點Glu蛋白表達均無顯著性差異（P＞0.05）；模型組缺血再灌注ld，Glu蛋白表達明顯升高，持續(xù)7d仍維持較高水平，與同時間點正常組、假手術(shù)組比較均有顯著性差異（P＜0.01）；電針經(jīng)穴組與同時間點模型組、電針非經(jīng)穴組比較均有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05）。

表2 各組腦缺血再灌注損傷大鼠Glu蛋白表達的比較±s）

表2 各組腦缺血再灌注損傷大鼠Glu蛋白表達的比較±s）

注：與同時間點正常組比較：＊＊P＜0.01；與同時間點假手術(shù)組比較：△△P＜0.01；與同時間點電針經(jīng)穴組比較：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組Glu 蛋白陽性目標(biāo)面密度1d 3d 7d正 常 組 6 0.0378±0.0047 0.0371±0.0021 0.0410±0.0071別n假 手 術(shù) 組 6 0.0409±0.0110 0.0392±0.0036 0.0383±0.0047模 型 組 6 0.1248 ±0.0171＊＊△△▲▲ 0.1176 ±0.0169＊＊△△▲▲ 0.1030 ±0.0255＊＊△△▲▲電針非經(jīng)穴組 6 0.1105±0.0181▲▲ 0.1044±0.0270▲▲ 0.0974±0.0307▲電針經(jīng)穴組 6 0.0610±0.0093 0.0515±0.0021 0.0518±0.0046

圖14 正常組（×400）

圖15 假手術(shù)組1d（×400）

圖16 假手術(shù)組3d（×400）

圖17 假手術(shù)組7d（×400）

圖18 模型組1d（×400）

圖19 模型組3d（×400）

圖20 模型組7d（×400）

圖21 電針非經(jīng)穴組 1d（×400）

圖22 電針非經(jīng)穴組3d（×400）

圖23 電針非經(jīng)穴組7d（×400）

圖24 電針經(jīng)穴組1d（×400）

圖26 電針經(jīng)穴組7d（×400）

3 討論

腦缺血再灌注損傷是指腦缺血一定時間恢復(fù)血液灌注后，腦組織細胞損傷反而進行性加重的病理現(xiàn)象。腦缺血再灌注損傷病理級聯(lián)反應(yīng)的惡性循環(huán)導(dǎo)致機體處于持續(xù)的惡性應(yīng)激刺激狀態(tài)，從而引起NEI網(wǎng)絡(luò)功能的紊亂，進一步加重腦缺血再灌注損傷［3］。神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)共同組成一個網(wǎng)絡(luò)狀的結(jié)構(gòu)和功能體系，三大系統(tǒng)具有共同的生化基礎(chǔ)，三者各具特點又密切相關(guān)，共同調(diào)控和整合機體內(nèi)、外環(huán)境的平衡。下丘腦是NEI網(wǎng)絡(luò)的高級整合中樞，為探討腦缺血再灌注損傷后下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的變化，本實驗將下丘腦作為實驗觀測的主要部位，以期揭示腦缺血再灌注損傷后下丘腦神經(jīng)遞質(zhì) β-EP、Glu蛋白表達的變化規(guī)律。

β-EP是神經(jīng)細胞產(chǎn)生的具有廣泛生物學(xué)活性的內(nèi)源性阿片肽，廣泛存在于垂體、下丘腦、大腦皮層、海馬回、腦干、血漿和腦脊液中，其中以下丘腦和垂體含量最高?？赏ㄟ^神經(jīng)分泌、旁分泌和內(nèi)分泌三種途徑分別起到神經(jīng)激素、神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)變物的作用，參與多種生理功能的調(diào)節(jié)，同時也參與許多疾病和應(yīng)激的病理過程。近年研究表明：腦缺血時 β-EP釋放是造成卒中病理損害的重要環(huán)節(jié)［4］，使用阿片受體拮抗劑納絡(luò)酮治療腦卒中有效以來［5、6］，證明內(nèi)啡肽拮抗劑可減輕、阻止甚至逆轉(zhuǎn)由內(nèi)啡肽所造成腦缺血再灌注損傷，拮抗 β-EP活性，減少內(nèi)源性 β-EP的釋放，降低腦組織總鈣和氧自由基水平，減少梗死體積，防止缺血性損害擴展。

Glu是腦組織中含量較高的一種重要氨基酸，同時也是一種重要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性遞質(zhì)。自1971年 olney首次提出“興奮性毒性”解釋缺血后Glu升高所引發(fā)的病理生理變化后，普遍認為氧和糖供應(yīng)減少引起的神經(jīng)元死亡，是因于細胞外興奮性氨基酸（EAA）遞質(zhì)劇增的結(jié)果，特別是 Glu。EAA指Glu和天冬氨酸（Asp），腦缺血再灌注時，大量的Glu使神經(jīng)元持續(xù)去極化，增加了神經(jīng)元內(nèi)Glu的大量釋放；又因腦缺血后ATP消耗，依賴能量而重吸收Glu的機制衰竭，影響Glu攝取功能，甚至出現(xiàn)Glu向細胞外液轉(zhuǎn)移，如此惡性循環(huán)，突觸間隙持續(xù)高濃度的Glu就引起興奮性神經(jīng)毒性，造成損傷［7］。

本研究結(jié)果顯示，與正常組、假手術(shù)組比較，模型組各時間點 β-EP、Glu蛋白表達均明顯增高，表明下丘腦β-EP、Glu蛋白表達水平與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)。電針經(jīng)穴組與同時間點模型組比較，β-EP、Glu蛋白表達明顯降低，表明電針經(jīng)穴對腦缺血再灌注損傷大鼠下丘腦 β-EP、Glu蛋白表達具有明顯的調(diào)節(jié)作用。電針經(jīng)穴組與同時間點電針非經(jīng)穴組比較，β-EP、Glu蛋白表達明顯降低，表明電針經(jīng)穴對腦缺血再灌注損傷大鼠下丘腦 β-EP、Glu蛋白表達的調(diào)節(jié)具有相對特異性。

腦缺血再灌注損傷可使下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)功能紊亂，進一步導(dǎo)致NEI網(wǎng)絡(luò)功能紊亂而加重腦缺血再灌注損傷，電針經(jīng)穴具有調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷大鼠下丘腦 β-EP、Glu蛋白表達的作用，從而進一步調(diào)控NEI網(wǎng)絡(luò)功能紊亂而發(fā)揮腦缺血再灌注損傷腦保護作用?？傊娽樈?jīng)穴對腦缺血再灌注損傷的保護作用機制可能與電針經(jīng)穴調(diào)節(jié)下丘腦β-EP、Glu蛋白表達水平有關(guān)。

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