王敬慧 張權(quán) 張卉 王群慧 楊新杰 顧艷斐 張樹(shù)才

肺癌居癌癥相關(guān)死亡病因的首位，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌的80%，2/3的患者確診時(shí)已為晚期。含鉑兩藥化療方案是NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)一線治療，客觀緩解率約為30%-40%，中位生存期為8個(gè)月-10個(gè)月，1年生存率為30%-40%。順鉑是肺癌化療方案的基本藥物之一，通過(guò)與DNA形成交聯(lián)復(fù)合物抑制DNA合成和轉(zhuǎn)錄，從而起到抗腫瘤的作用。切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組1（excision repair cross-complementing group 1, ERCC1）是核苷酸切除修復(fù)途徑的重要成分，通過(guò)對(duì)鉑類-DNA復(fù)合物的切除修復(fù)而影響鉑類藥物的療效。研究顯示ERCC1 C8092A和第118位密碼子位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism, SNP）在預(yù)測(cè)晚期NSCLC患者鉑類化療療效方面有一定的價(jià)值，但研究結(jié)果仍存在爭(zhēng)議。本研究通過(guò)對(duì)晚期NSCLC患者化療前外周血基因組ERCC1 C8092A、118密碼子基因型進(jìn)行分型，探討C8092A、密碼子118多態(tài)性與含鉑化療療效的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2008年5月-2009 年 5月期間在北京胸科醫(yī)院腫瘤內(nèi)科經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)確診的晚期NSCLC初治患者90例：中位年齡55歲（33歲-73歲）；男性63例，女性27例；腺癌69例，鱗癌20例，腺鱗癌1例；IIIb期30例，IV期60例。全部患者均接受含順鉑兩藥方案化療，中位化療周期數(shù)為4周期。方案：順鉑/紫杉醇40例、順鉑/長(zhǎng)春瑞濱7例、順鉑/吉西他濱36例、順鉑/培美曲噻7例，隨訪日期截至2009年7月31日，77例患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展，其余13例未進(jìn)展。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 DNA提取，化療前采用EDTA抗凝負(fù)壓管抽取靜脈血標(biāo)本3 mL-5 mL，Miller法提取外周血基因組DNA。引物序列：C8092A：上游引物5’-ACAGT GCCCCAAGAGGAGAT-3’，下游引物5’-AGTCTCTGG GGAGGGATTCT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物204 bp；ERCC1 118：上游引物5’-CCAGAACACTGGGACAT-3’，下游引物5’-TCAGAGGATCAGGGACT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物399 bp。引物由北京賽百盛生物公司合成。PCR反應(yīng)條件：C8092A：95oC、5 min，95oC、30 s，59oC、30 s，72oC、45 s，35個(gè)循環(huán)，72oC、10 min；ERCC1 118：95oC、5 min，95oC、30 s，54oC、30 s，72oC、45 s，35個(gè)循環(huán)，72oC、10 min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。將有陽(yáng)性結(jié)果的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用Bioedit軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與ERCC1基因組序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)ERCC1基因C8092A、118位點(diǎn)基因型，測(cè)序由北京天根生化科技有限公司完成。

1.3 療效評(píng)價(jià)及生存記錄 按RECIST標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效評(píng)價(jià)：完全緩解（complete response, CR）：所有目標(biāo)病灶消失且持續(xù)4周；部分緩解（partial response, PR）：腫瘤最大徑之和至少減少30%，并保持4周以上；疾病進(jìn)展（progressive disease, PD）：基線病灶長(zhǎng)徑總和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶；病灶穩(wěn)定（stable disease, SD）：縮小未達(dá)PR或增加未到PD；CR和PR者需經(jīng)4周后確認(rèn)。參考國(guó)內(nèi)外同類研究，設(shè)定CR+PR為有效，SD+PD為無(wú)效。以進(jìn)入研究起始時(shí)間為起點(diǎn)，疾病進(jìn)展時(shí)間作為終點(diǎn)記錄患者無(wú)進(jìn)展生存期（progression free survival, PFS）。對(duì)于在隨訪截止日期無(wú)進(jìn)展的病例，在統(tǒng)計(jì)時(shí)作為刪失數(shù)據(jù)處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。率的比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher's精確概率檢驗(yàn)進(jìn)行分析；生存分析采用Kaplan-Meier法，各因素水平間比較用Log-rank分析，Cox回歸模型分析預(yù)后相關(guān)因素。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERCC1 C8092A、118基因型頻率 90例晚期NSCLC患者ERCC1 C8092A位點(diǎn)存在3種等位基因型，基因頻率分別為：CC 40.0%（36/90）、CA 48.9%（44/90）、AA 11.1%（10/90）；ERCC1 118存在3種等位基因型，基因頻率分別為：CC 58.9%（53/90）、CT 34.4%（31/90）、TT 6.7%（6/90）。不同年齡、性別、吸煙狀況、病理類型、臨床分期患者間ERCC1 C8092A、118多態(tài)性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 ERCC1 C8092A、118多態(tài)性與療效的相關(guān)性 90例晚期NSCLC患者經(jīng)療效評(píng)價(jià)后，0例CR，27例（30.0%）PR，50例（55.6%）SD，13例（14.4%）PD，總有效率（CR+PR）為30.0%。ERCC1 C8092A CC基因型患者化療有效12例，無(wú)效24例，CA+AA基因型化療有效16例，無(wú)效38例，CC和CA+AA患者療效間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.71）。ERCC1 118 CC基因型化療有效17例，無(wú)效36例，CT+TT基因型患者化療有效9例，無(wú)效28例，CC和CT+TT患者療效間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.43）（表1）。C8092A、118多態(tài)聯(lián)合分析顯示，ERCC1兩個(gè)位點(diǎn)同為CC基因型患者療效與其它基因型患者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.12）（表2）。

2.3 ERCC1 C8092A、118多態(tài)性與PFS的相關(guān)性 ERCC1 C8092A CC基因型患者的中位PFS為5.2個(gè)月，CA或AA基因型患者的中位PFS為5.4個(gè)月，Log-rank分析無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.62）（圖1A）；ERCC1 118 CC基因型患者中位PFS為5.5個(gè)月，CT或TT基因型患者中位PFS為5.3個(gè)月，Log-rank分析無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.59）（圖1B）；ERCC1 C8092A、118聯(lián)合多態(tài)性與PFS無(wú)關(guān)（P=0.42）。經(jīng)Cox回歸多因素分析，ERCC1 C8092A、118多態(tài)性均不是晚期NSCLC患者PFS的獨(dú)立因素。

表1 晚期NSCLC患者ERCC1 C8092A、118多態(tài)性與含鉑化療療效的關(guān)系Tab 1 Genotype frequencies in patients with advanced NSCLC and response to cisplatin-based chemotherapy according to genotype

表2 晚期NSCLC患者ERCC1 C8092A、118多態(tài)聯(lián)合與含鉑化療療效的關(guān)系Tab 2 Genotype frequencies in patients with advanced NSCLC and response to cisplatin-based chemotherapy according to combination of genotype in C8092A and 118

3 討論

SNP是基因水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換以及單堿基插入或缺失等形式，是人類可遺傳變異中最常見(jiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上?；蛐蛄兄袉蝹€(gè)堿基的變異引起編碼的氨基酸發(fā)生改變，從而影響基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能。SNP與許多疾病的易感性及治療療效等相關(guān)。DNA修復(fù)基因包括核苷酸切除修復(fù)基因、堿基切除修復(fù)基因、DNA鏈斷裂修復(fù)基因、錯(cuò)配修復(fù)基因和直接逆轉(zhuǎn)損傷的修復(fù)基因等。DNA修復(fù)能力是影響鉑類療效的重要原因，其中核苷酸切除修復(fù)與鉑類藥物耐藥最為密切，ERCC1基因在核苷酸切除修復(fù)途徑中起重要作用[1]。C8092A和第118位密碼子是ERCC1基因多態(tài)性被研究最為廣泛的兩個(gè)位點(diǎn)。C8092A位于ERCC1基因的3’非編碼區(qū)，可能與ERCC1 mRNA翻譯有關(guān)。ERCC1第118位密碼子基因C型變異為T型，核苷酸序列由AAC變?yōu)锳AT，雖然沒(méi)有導(dǎo)致氨基酸的替代，生成的仍為天冬酰胺，但會(huì)影響ERCC1 mRNA和蛋白水平及/或?qū)е屡c其它功能性SNPs的連鎖不平衡，使個(gè)體對(duì)鉑類藥物的敏感性產(chǎn)生差異，影響鉑類藥物療效[2]。Park等[3]證明ERCC1 118 C變異為T，CT或TT等位基因使ERCCl mRNA水平增高，DNA修復(fù)能力增強(qiáng)，患者對(duì)鉑類藥物的敏感性降低，野生型基因（CC）患者對(duì)含鉑化療更敏感。

圖1 ERCC1 C8092A（A）和118（B）各基因型PFS比較Fig 1 Kaplan-Meier curves of PFS according to ERCC1 C8092A (A) and 118 (B)genotypePFS: progression free survival.

本文前瞻性研究90例EERCC1基因C8092A、第118位密碼子多態(tài)性能否預(yù)測(cè)接受含鉑化療晚期NSCLC患者的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，90例晚期NSCLC患者ERCC1基因C8092A三種基因型頻率分別為40.0%（CC）、48.9%（CA）、11.1%（AA），第118位密碼子的三種基因型頻率分別為 58.9%（CC）、34.4%（CT）、 6.7%（TT），兩種基因型多態(tài)性在不同年齡、性別、吸煙狀況、病理類型、臨床分期間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本文結(jié)果顯示，C8092A各基因型有效率相近，118密碼子CC基因型有效率高于CT及TT基因型，但二者多態(tài)性與療效均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ERCC1 C8092A和118各基因型的PFS相近，兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與PFS均無(wú)相關(guān)性。多態(tài)性聯(lián)合分析結(jié)果提示兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)為CC基因型的有效率達(dá)46.7%，明顯高于其它基因型組合，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，值得擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

國(guó)內(nèi)袁芃等[4]檢測(cè)了200例接受含鉑方案化療的晚期NSCLC患者ERCC1基因C8092A多態(tài)性，多態(tài)性與療效（CR+PR與SD+PD比較）不相關(guān)。柳艷飛等[5]報(bào)告94例接受紫杉醇聯(lián)合順鉑化療的晚期NSCLC患者第118位密碼子各基因型與臨床受益率及1年生存率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高長(zhǎng)明等[6]報(bào)告57例接受吉西他濱聯(lián)合順鉑化療的晚期NSCLC患者的第118位密碼子CC基因型療效高于CT基因型（有效率分別為46.4%、23.1%），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。意大利作者Tabldi等[7]報(bào)告，65例接受順鉑聯(lián)合吉西他濱治療的晚期初治NSCLC患者的118多態(tài)性與療效及預(yù)后不相關(guān)。西班牙Delas等[8]報(bào)告，135例接受順鉑、吉西他濱化療的晚期NSCLC患者118多態(tài)性與患者的預(yù)后無(wú)關(guān)。但也有不同的研究結(jié)果。Zhou等[9]研究了128例接受含鉑方案化療NSCLC患者ERCC1基因C8092A 位點(diǎn)的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)CC基因型患者M(jìn)ST為22.3個(gè)月，CA和AA基因型患者M(jìn)ST為13.4個(gè)月（P=0.006）。Su等[10]對(duì)76例接受含鉑化療的晚期NSCLC患者研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，ERCC1 118 CC基因型與化療療效顯著相關(guān)，比含T（TT+CT）等位基因患者化療的有效率高（OR=4.10, 95%CI 1.31-12.85）。韓國(guó)Ryu等[11]研究發(fā)現(xiàn)109例晚期NSCLC接受含順鉑聯(lián)合方案化療患者118密碼子各基因型間的療效無(wú)差異，但CC基因型患者的生存期顯著長(zhǎng)于TT或CT基因型患者（MST分別為486天和281天，P=0.005 8）。西班牙Isla等[12]報(bào)告，62例多西紫杉醇聯(lián)合順鉑治療的晚期NSCLC患者118密碼子CC基因型的預(yù)后顯著優(yōu)于CT或TT基因型患者。希臘Kalikaki等[13]報(bào)告接受含鉑化療的晚期NSCLC患者ERCC1基因C8092A多態(tài)性與生存顯著相關(guān)，CA或AA基因型患者生存期顯著優(yōu)于CC基因型（MST分別為9.8個(gè)月和14.1個(gè)月，P=0.009），118密碼子多態(tài)性與療效（CR+PR與SD+PD比較）相關(guān)，含C基因型患者（CC、CT）有效率顯著高于TT基因型（P=0.012）。

各研究結(jié)果的不一致可能受入組病例數(shù)、化療方案、基因型檢測(cè)方法等因素影響，也與不同種族基因型頻率分布顯著不同有關(guān)[14]。ERCC1基因多態(tài)性影響晚期NSCLC患者鉑類化療療效及生存期的機(jī)制尚未完全闡明，如果將ERCC1 mRNA以及蛋白表達(dá)共同融合到ERCC1 C8092A、118密碼子基因多態(tài)性研究中，探討其相互影響的機(jī)制，可能有助于闡明ERCC1多態(tài)性對(duì)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯的作用。ERCC1基因多態(tài)性能否為個(gè)體化治療提供選擇藥物的依據(jù)，還需要進(jìn)行更大樣本更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床研究來(lái)明確RCC1基因多態(tài)性對(duì)晚期NSCLC患者含鉑化療療效及生存的作用。

本試驗(yàn)樣本量不是非常大，化療方案較多，可能對(duì)結(jié)果有些影響。因本組患者隨訪期不長(zhǎng)，本文僅對(duì)ERCC1多態(tài)性與PFS的關(guān)系作了探討，尚不能進(jìn)行ERCC1多態(tài)性預(yù)測(cè)患者生存期的分析，我們將繼續(xù)對(duì)全組患者進(jìn)行隨訪，并在今后對(duì)ERCC1基因多態(tài)性與晚期NSCLC患者生存的關(guān)系作出評(píng)價(jià)。