李菲 鐘志永 李銳 黃鶴宇 王麗君 鄭東晗 張道榮

hASH1（human achaete-scute homolog 1）基因是一個(gè)bHLH（basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子，首先從甲狀腺髓樣癌的cDNA文庫(kù)中克隆出來(lái)，位于12q22-q23[1,2]。在脊椎動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程中，ASH1基因通常只暫時(shí)性地表達(dá)于胚胎肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的早期分化階段，在終末分化標(biāo)記物出現(xiàn)后其表達(dá)趨于沉默[3]。已有研究表明在具有神經(jīng)內(nèi)分泌分化的前列腺癌[4]、甲狀腺髓樣癌[5]、胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌[6]中有hASH1基因的表達(dá)。目前臨床常用的非激素類神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤標(biāo)志物有嗜鉻粒蛋白A（Chromogranin A, CgA）、突觸素（Synaptophysin, Syn）和CD56等。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)方法、Western blot和RT-PCR方法檢測(cè)肺腫瘤和正常肺組織中hASH1基因的表達(dá)情況，探討其作為更為特異和敏感的臨床病理診斷肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的標(biāo)志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 收集166例肺癌組織蠟塊（鱗癌30例，腺癌30例，大細(xì)胞癌20例，典型類癌16例，非典型類癌20例，大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌10例，小細(xì)胞癌40例），其中35例取自遼寧省腫瘤醫(yī)院，其余取自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院，49例肺炎性假瘤及10例癌旁正常肺組織蠟塊取自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院。其中23例肺癌蠟塊有新鮮組織標(biāo)本，9例鱗癌、9例腺癌和5例小細(xì)胞癌新鮮組織均取自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院2008年5月-2009年5月手術(shù)切除標(biāo)本，術(shù)中切除后立即置于-70oC冰箱保存，用于提取組織蛋白和RNA。

1.2 主要試劑和來(lái)源 濃縮型兔抗人ASH1多克隆抗體（ab38557）購(gòu)自Abcam公司，即用型鼠抗人Chromogranin A單克隆抗體（MAB-0202）、鼠抗人Synaptophysin單克隆抗體（MAB-0078）、鼠抗人CD56單克隆抗體（RAB-0256）及即用型SP超敏免疫組織化學(xué)試劑盒（KIT-9710）和DAB酶底物顯色試劑盒（DAB-0031）均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。ECL超敏發(fā)光液P1010和RIPA裂解液C1053購(gòu)自普利萊基因技術(shù)公司。濃縮型辣根酶標(biāo)記山羊抗兔（ZB-2301）、山羊抗鼠（ZB-2305）抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。RNA抽提試劑盒Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，RT-PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司，引物序列合成由南京金思特有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 蠟塊標(biāo)本制成4 μm切片，經(jīng)脫蠟、脫苯、水化后，采用鏈菌素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶免疫組化法（SP法）檢測(cè)，具體步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所有標(biāo)本均檢測(cè)hASH1（1:100）蛋白，所有肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌標(biāo)本均檢測(cè)CgA、Syn和CD56的表達(dá)情況。每次染色均設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.3.2 Western blot檢測(cè) 從組織內(nèi)提取細(xì)胞全蛋白, 取50 mg左右的組織塊，加入500 μL裂解液中，冰浴下勻漿后，低溫高速離心（4oC、12 000 g/min、20 min），收集上清。用考馬斯亮蘭法，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行蛋白定量，計(jì)算各樣品蛋白濃度。取總蛋白量80 μg上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。電泳條件：穩(wěn)定電壓80 V、30 min，待濃縮膠將蛋白質(zhì)濃縮成一條直線后調(diào)至120 V、2 h，待溴芬蘭進(jìn)入凝膠底部后取出凝膠，根據(jù)預(yù)染Maker（Fermentas公司）標(biāo)記切取所需相應(yīng)分子量蛋白條帶，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上（40 V恒壓，4oC濕轉(zhuǎn)100 min）， 5%脫脂奶粉封閉2 h，加兔抗人ASH1抗體（1:500），4oC孵育過(guò)夜，TTBS（20 mmol/L Tris-HCL,500 mmol/L NaCl, 0.05% Tween-20）漂洗3次后，加山羊抗兔（1:5 000）二抗溫育120 min，TTBS漂洗3次后行ECL顯色，X線膠片曝光成像，以β-actin為內(nèi)參照，最后經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集圖像。

1.3.3 RT-PCR檢測(cè) 利用Trizol提取組織中總的RNA，具體操作步驟參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，總RNA純度和濃度使用紫外分光光度計(jì)（NanoPhotometer, Germany）測(cè)定，經(jīng)測(cè)定所用樣品的A260/A280比值都在1.8-2.0之間。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按說(shuō)明書(shū)操作。hASH1引物：上游序列5’-TCCCCCAACTACTCCAACGAC-3’，下游序列是5’-CCCTCCCAACGCCACTG-3’，產(chǎn)物大小為233 bp；內(nèi)參β-actin引物：上游5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGA AAC-3’，下游5’-TAAAACGCAGCTCGATAACAGTCCG-3’，產(chǎn)物大小為250 bp。循環(huán)條件為：94oC預(yù)變性5 min，94oC變性30 s，55oC退火30 s，72oC延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后于72oC延伸5 min，最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后保存圖像。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 hASH1在細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色細(xì)小顆粒者為陽(yáng)性染色，CgA、Syn在細(xì)胞漿呈現(xiàn)棕黃色細(xì)小顆粒者為陽(yáng)性染色，CD56在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿呈現(xiàn)棕黃色細(xì)小顆粒者為陽(yáng)性染色。每張切片在400倍鏡下觀察10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%-50%為2分，50%-75%為3分，≥75%為4分；再按染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0，淡色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；最后按照乘積分?jǐn)?shù)分為4個(gè)等級(jí)：“-”（0-2），“+”（3-5），“++”（6-8），“+++”（9-12）。染色結(jié)果判定：分?jǐn)?shù)≥3定為陽(yáng)性，＜3為陰性。

1.4.2 Western blot結(jié)果判定 hASH1的條帶在25 kDa處，用圖像分析軟件測(cè)定各樣品灰度值，并取其與β-actin的比值作為相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較分析。

1.4.3 RT-PCR結(jié)果判定 hASH1在233 bp處出現(xiàn)高亮條帶，用圖像分析軟件測(cè)定各樣品光密度值，并取其與β-actin的比值作為相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)hASH1在各種肺組織中表達(dá)的差異采用χ2檢驗(yàn)（n＞40）或Fisher確切概率法（n＜40）分析，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析hASH1與CgA、Syn、CD56表達(dá)的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果

2.1.1 hASH1在正常肺組織、肺炎性假瘤和非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況 在10例正常肺組織、49例肺炎型假瘤、30例鱗癌、30例腺癌和20例大細(xì)胞癌中均無(wú)hASH1的表達(dá)。

2.1.2 hASH1在類癌中的表達(dá)情況 在16例典型類癌中有2例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為12.5%，在20例非典型類癌中有15例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為75%（圖1），hASH1在典型類癌和非典型類癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 hASH1、CgA、Syn和CD56分別在TC、AC、LCNEC和SCLC中的表達(dá)情況（SP, ×400）TC：典型類癌；AC：不典型類癌；LCNEC：大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌；SCLC：小細(xì)胞肺癌；hASH1：human achaete-scute homolog 1；CgA：嗜鉻粒蛋白A；Syn：突觸素。Fig 1 Expression of hASH1, CgA, Syn and CD56 in TC, AC, LCNEC and SCLC respectively (SP, ×400)TC: typical carcinoid; AC: atypical carcinoid; LCNEC: large cell neuroendocrine carcinoma; SCLC: small cell lung cancer; hASH1: human achaete-scute homolog 1;CgA: Chromogranin A; Syn: Synaptophysin.

圖2 Western blot檢測(cè)hASH1蛋白在肺癌組織中的表達(dá)A：肺鱗癌、腺癌和小細(xì)胞癌組織中hASH1和β-actin的蛋白表達(dá)情況，以β-actin為內(nèi)參；B：hASH1的蛋白表達(dá)量與β-actin相比后的相對(duì)表達(dá)量?？梢?jiàn)在肺鱗癌、腺癌中均無(wú)hASH1蛋白的表達(dá)，在5例小細(xì)胞癌中hASH1蛋白的表達(dá)均較高；SC：鱗癌；AC：腺癌。Fig 2 Expression of hASH1 protein in different lung cancer tissues by Western blotA: Western blot results of hASH1 protein expression in squamous cell carcinoma, adenocarcinomas and small cell lung carcimoma, β-actin served as an internal control; B: The histogram of relative expression rate of hASH1 protein compared to β-actin. There is no expression of hASH1 protein in squamous cell carcinoma and adenocarcinomas, but in five small cell lung carcimoma the expression level is high; SC: squamous cell carcinoma; AC: adenocarcinomas.

圖3 RT-PCR檢測(cè)hASH1 mRNA在肺癌組織中的表達(dá)A：肺鱗癌、腺癌和小細(xì)胞癌組織中hASH1和β-actin的mRNA經(jīng)RT-PCR后的電泳結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參；B：hASH1 mRNA表達(dá)量與β-actin相比后的相對(duì)表達(dá)量?？梢?jiàn)在肺鱗癌、腺癌中均無(wú)hASH1 mRNA的表達(dá)，在5例小細(xì)胞癌中hASH1 mRNA均高表達(dá)。Fig 3 Expression of hASH1 mRNA in different lung cancer tissues by RT-PCRA: RT-PCR results of hASH1 mRNA expression in squamous cell carcinoma,adenocarcinomas and small cell lung carcimoma, β-actin served as an internal control; B: The histogram of relative expression rate of hASH1 mRNA compared to β-actin.There is no expression of hASH1 mRNA in squamous cell carcinoma and adenocarcinomas, but in five small cell lung carcimoma the expression level is high.

表1 在肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌中hASH1與CgA、Syn、CD56表達(dá)的關(guān)系Tab 1 Correlation of expression between hASH1and CgA, Syn, CD56 in pulmonary neuroendocrine carcinoma

2.1.3 hASH1在大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和小細(xì)胞癌中的表達(dá)情況 在10例大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌中有6例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為60%，在40例小細(xì)胞癌中31例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為77.5%（圖1），hASH1在大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和小細(xì)胞癌中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.42），hASH1在典型類癌和小細(xì)胞癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.1.4 神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物在肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的表達(dá)及與hASH1的關(guān)系 在36例類癌中，27例（75.0%）CgA陽(yáng)性，26例（72.2%）Syn陽(yáng)性，29例（80.6%）CD56陽(yáng)性。在50例大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和小細(xì)胞癌中，24例（48.0%）CgA陽(yáng)性，38例（76.0%）Syn陽(yáng)性，42例（84.0%）CD56陽(yáng)性（圖1）。統(tǒng)計(jì)分析顯示hASH1與CgA、Syn、CD56的表達(dá)均存在相關(guān)性（P＜0.05）（表1）。

2.2 Western blot檢測(cè)hASH1在肺鱗癌、腺癌和小細(xì)胞癌中蛋白的表達(dá) 在5例小細(xì)胞癌組織中均有hASH1基因的高表達(dá)，在9例鱗癌和9例腺癌組織中均無(wú)hASH1基因的表達(dá)（圖2）。

2.3 RT-PCR檢測(cè)hASH1在肺鱗癌、腺癌和小細(xì)胞癌中mRNA的表達(dá) 在5例小細(xì)胞癌組織中均有hASH1基因的表達(dá)，在9例鱗癌和9例腺癌組織中均物hASH1基因的表達(dá)（圖3）。

3 討論

hASH1基因編碼含有238個(gè)氨基酸的前體蛋白，該蛋白與MASH1（mouse achaete-scute homolog 1, MASH1）蛋白有95%的同源性，主要通過(guò)結(jié)合靶基因啟動(dòng)子的E-box（核心序列為5′-CANNTG-3′）而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，該過(guò)程還需要與其它bHLH蛋白形成二聚體才能與DNA有效的結(jié)合[1]。hASH1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、腎上腺嗜鉻細(xì)胞、甲狀腺C細(xì)胞、肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞等多種組織細(xì)胞的早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用[1,7,8]。

在鼠胚胎發(fā)育中敲除ASH1基因，會(huì)影響到神經(jīng)內(nèi)分泌分化，導(dǎo)致肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的缺失，而肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞又與肺小細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)[9]。相反，在轉(zhuǎn)基因鼠中過(guò)表達(dá)ASH1能夠促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞的增生，ASH1與SV40（simian virus 40, SV40）大T抗原共同轉(zhuǎn)染能夠促進(jìn)具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的肺腫瘤的形成[10]。最近，Osada等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在有ASH1表達(dá)的肺癌細(xì)胞系中以RNAi的方式抑制ASH1的表達(dá)能夠引起腫瘤細(xì)胞在G2-M期細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，其分子機(jī)制可能與半胱天冬酶-9和7的激活有關(guān)。人體活組織實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hASH1在各種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤包括肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid cancer, MTC）以及胎兒肺的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中都有表達(dá)，而在無(wú)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的腫瘤和正常組織中卻未發(fā)現(xiàn)hASH1的表達(dá)[12]。這些均表明hASH1基因與具有神經(jīng)內(nèi)分泌分化特征的腫瘤密切相關(guān)。

由于典型類癌、非典型類癌和大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌的發(fā)病率較低，我們未收集到這幾種肺癌的新鮮標(biāo)本，肺小細(xì)胞癌在臨床上多采用非手術(shù)治療，本實(shí)驗(yàn)也僅收集到5例新鮮標(biāo)本，Western blot和RT-PCR的結(jié)果均顯示在這5例小細(xì)胞癌中均有hASH1基因的高表達(dá)，而在9例鱗癌和9例腺癌中均無(wú)hASH1基因的表達(dá)。免疫組化結(jié)果也顯示hASH1基因的表達(dá)僅限于具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的肺癌中，在正常肺組織、肺炎性假瘤、鱗癌、腺癌及大細(xì)胞癌中均未檢測(cè)到hASH1基因的表達(dá)，這說(shuō)明hASH1基因?qū)Ψ紊窠?jīng)內(nèi)分泌腫瘤有高度特異性，可用于臨床病理診斷。而且在除典型類癌外的其它肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌中，hASH1基因的表達(dá)陽(yáng)性率均較高，提示hASH1基因?qū)υ\斷肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌有較高的敏感性。另一方面，hASH1基因在典型類癌中表達(dá)較低（12.5%），而在非典型類癌和小細(xì)胞癌中的表達(dá)陽(yáng)性率均很高（75%和77.5%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。典型類癌具有較明顯和成熟的內(nèi)分泌表型，分化較高，一般無(wú)壞死，分裂像罕見(jiàn)，屬于低度惡性，其生物學(xué)行為近似良性腫瘤，預(yù)后較好，5年生存率達(dá)90%以上；非典型類癌分化較典型類癌差，癌巢中有壞死，核分裂像多見(jiàn)，屬于中度惡性，預(yù)后也較典型類癌差；小細(xì)胞癌是肺癌中分化最低、惡性程度最高的一種類型，生長(zhǎng)迅速，轉(zhuǎn)移早，5年生存率僅1%-2%，這些均提示hASH1基因的表達(dá)與腫瘤的分化程度密切相關(guān)，分化程度越低hASH1基因的表達(dá)陽(yáng)性率越高，但hASH1基因能否作為判斷患者預(yù)后的指標(biāo)有待進(jìn)一步的研究。

總之，hASH1基因?qū)Ψ紊窠?jīng)內(nèi)分泌腫瘤具有高度特異性和敏感性，有可能成為肺神經(jīng)分泌腫瘤尤其是肺小細(xì)胞癌的臨床病理診斷標(biāo)志物，其與CgA、Syn、CD56聯(lián)合檢測(cè)，有望將肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的臨床病理診斷提高到一個(gè)新的水平。