張卉 張樹(shù)才 張宗德 賈紅彥 古淑香 趙丹

近年來(lái)隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在真核生物基因表達(dá)調(diào)控中起著重要的作用。在肺癌組織中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列抑癌基因存在啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化所導(dǎo)致的失活現(xiàn)象。其中部分抑癌基因的高甲基化與腫瘤發(fā)生、病情進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)，提示基因的甲基化可能是肺癌診斷、治療和預(yù)后評(píng)價(jià)的生物學(xué)標(biāo)志之一。

自2000年Dammann等[1]從人染色體3p21.3區(qū)域分離鑒定出RASSF1A并確定其為一新型抑癌基因至今，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與肺癌患者預(yù)后相關(guān)。國(guó)內(nèi)亦有關(guān)于RASSF1A在腫瘤組織中表達(dá)異常的報(bào)道，但與肺癌預(yù)后相關(guān)性報(bào)道較少，因此我們就非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中RASSF1A異常甲基化與患者生存預(yù)后進(jìn)行了臨床研究。

1 材料與方法

1.1 材料 所取病例標(biāo)本為1999年-2000年北京胸部腫瘤結(jié)核病醫(yī)院胸外科進(jìn)行手術(shù)切除的150例NSCLC組織和20例肺部良性病變組織。手術(shù)切除組織標(biāo)本即刻-70oC低溫保存。每例腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)高倍境下確定腫瘤細(xì)胞≥80%。所有病例術(shù)前均未經(jīng)放療和化療。150例NSCLC病例中男性121例，女性29例；年齡為31歲-78 歲，平均年齡為（59±9）歲；其中腺癌40例，鱗癌102例，腺鱗癌8例；根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤TNM分期為I期49例，II期32例，IIIa期48例，IIIb-IV期21例，腫瘤分化程度為低分化62例，中分化58例，高分化30例。

1.2 DNA提取 酚/氯仿抽提法。

1.3 DNA的亞硫酸氫鹽修飾 取1 μg-2 μg基因組DNA，加雙蒸水至50 μL，加入5 μL 3 mol/L的NaOH 37oC變性30 min；加入520 μL新配制的3 mol/L亞硫酸氫鈉（pH5.0）和30 μL 10 mmol/L的對(duì)苯二酚，50oC保溫16 h；純化回收DNA（Qiaquick gel extraction kit）。

1.4 巢式甲基化特異性的PCR（methylation-specific polymerase chain reaction, MS-PCR） 取亞硫酸氫鹽修飾后DNA 1 μL為模板，以經(jīng)Sss I酶修飾的Hep-2細(xì)胞DNA為陽(yáng)性對(duì)照，水為陰性對(duì)照。引物由北京賽百盛生物公司合成并純化（表1）。采用沉降PCR和熱啟動(dòng)PCR。PCR反應(yīng)體系為25 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，DMSO 1.2 μL，2×Taq PCR Master Mix（天根生化科技有限公司）12.5 μL，最后加去離子水補(bǔ)齊至25 μL。第一輪擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：94oC 3 min后，94oC 30 s，46oC-53oC 50 s，72oC 1 min，27次循環(huán)，72oC延伸10 min。第二輪擴(kuò)增參數(shù)：94oC 3 min后，94oC 30 s，58oC-65oC 50 s，72oC 1 min，37次循環(huán)，72oC延伸10 min。

1.5 結(jié)果記錄 將25 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外線凝膠成像及分析系統(tǒng)（BIO-RAD公司）下掃描拍照，記錄結(jié)果。

1.6 產(chǎn)物測(cè)序 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收（Qiaquick gel extraction kit），連接轉(zhuǎn)化涂板，挑取陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，相關(guān)性以χ2檢驗(yàn)和Fisher's精確檢驗(yàn)進(jìn)行分析；生存資料分析采用Kaplan-Meier法，各因素水平間比較用Log-rank分析，分析預(yù)后相關(guān)因素使用Cox回歸模型，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài) 150例NSCLC中58例RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，發(fā)生甲基化率為38.7%；20例肺部良性病變中無(wú)1例RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化（圖1）。

2.2 RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化與臨床病理因素之間的關(guān)系RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與年齡、性別、吸煙指數(shù)、腫瘤TNM分期均不相關(guān)，但與開(kāi)始吸煙年齡、腫瘤分化程度相關(guān)。20歲前開(kāi)始吸煙的NSCLC患者RASSF1A啟動(dòng)子甲基化率（56.7%）高于20歲后開(kāi)始吸煙的NSCLC患者（28.2%）（P=0.006）；低分化NSCLC患者RASSF1A啟動(dòng)子甲基化率（51.6%）高于中分化（31.0%）和高分化（26.7%）NSCLC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022,P=0.024），但中分化和高分化NSCLC之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

2.3 術(shù)后生存時(shí)間與RASSF1A啟動(dòng)子甲基化相關(guān)性 150例NSCLC術(shù)后中位生存期為33個(gè)月，58例RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，術(shù)后中位生存期為22個(gè)月，92例未發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，術(shù)后中位生存期為57個(gè)月（P=0.004）（圖2A）；49例I期NSCLC術(shù)后中位生存期為80個(gè)月，13例RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化，術(shù)后中位生存期為58個(gè)月，36例未發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，術(shù)后中位生存期為80個(gè)月（P=0.022）（圖2B）；32例II期NSCLC術(shù)后中位生存期為32個(gè)月，12例RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，術(shù)后中位生存期為24個(gè)月，20例未發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，術(shù)后中位生存期為80個(gè)月（P=0.023）（圖2C）；48例IIIa期NSCLC術(shù)后中位生存期為23個(gè)月，24例RASSFA啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，術(shù)后中位生存期為18個(gè)月，24例未發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，術(shù)后中位生存期為31個(gè)月（P=0.036）（圖2D）；21例IIIb-IV期NSCLC中，9例RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，術(shù)后中位生存期為15個(gè)月，12例未發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，術(shù)后中位生存期為15個(gè)月（P=0.118）（圖2E）。

表1 RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性PCR擴(kuò)增引物序列Tab 1 MSP primer sequence of RASSF1A promter

圖1 腫瘤組織、良性病變及癌旁正常組織甲基化特異性PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig 1 Methylation analysis of RASSF1A by MSP in tissue of tumor, benign lesion and normal tissueT1: begin lesion; T2: normal tissue; T3 and T4: lung cancer tissue; P: positive control; N: negative control; U, amplified product with primers recognizing the unmethylated sequences; M: amplified product with primers recognizing the methylated sequences.Hep-2 DNA methlated with Sss I methyltransferase as a positive control and distilled water was used as a negative control.

表2 RASSF1A啟動(dòng)子甲基化與臨床病理因素之間的關(guān)系Tab 2 Association between methylation of RASSF1A promoter and clinicopathologic variables

2.4 RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是NSCLC術(shù)后的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后相關(guān)因素 利用Cox回歸模型，分析NSCLC中的各種因素（年齡、組織類型、分化程度、TNM分期、吸煙、開(kāi)始吸煙年齡、甲基化狀態(tài)等），發(fā)現(xiàn)除病理分期外RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)也是一個(gè)與NSCLC術(shù)后預(yù)后有關(guān)的因素（RR=1.584, 95%CI: 1.040-2.411, P=0.032）（表3）。

圖2 NSCLC術(shù)后RASSF1A甲基化狀態(tài)相關(guān)生存曲線Fig 2 Survival curves with reference to RASSF1A promoter methylationA: Overall survival curves for all 150 NSCLC cases; B: Survival curves for patients with 49 NSCLC cases (Stage I); C: Survival curves for patients with 32 NSCLC cases (Stage II); D: Survival curves for patients with 48 NSCLC cases(Stage IIIa); E: Survival curves for patients with 21 NSCLC cases (Stage IIIb and IV).

3 討論

目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了在NSCLC、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、腎癌、食道癌[2]、前列腺癌、膠質(zhì)瘤[3]等多種腫瘤中存在RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化?，F(xiàn)已明確抑癌基因RASSF1A在肺癌等腫瘤中表達(dá)失活的機(jī)制是由于啟動(dòng)子區(qū)CpG島的特異性高甲基化所致。雖然抑癌基因的失活也可由突變所致，但對(duì)該基因的研究結(jié)果顯示，RASSF1A的突變率還不及10%，而RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生高甲基化的比率在小細(xì)胞肺癌、NSCLC細(xì)胞系中分別高達(dá)72%-100%、36%-88%，在NSCLC中啟動(dòng)子區(qū)高甲基化達(dá)30%-45%[4-7]，同時(shí)非惡性組織肺組織中無(wú)一例發(fā)生甲基化。在研究中還發(fā)現(xiàn)，RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化與肺癌腫瘤細(xì)胞分化程度、開(kāi)始吸煙年齡有關(guān)[8,9]，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與之相同。這一結(jié)果從側(cè)面證實(shí)了RASSF1A啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可能作為預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)，并且早期吸煙可能是造成RASSF1A表觀遺傳改變的分子事件[10]。

表3 150例NSCLC預(yù)后多因素Cox回歸分析Tab 3 Survival outcome by multivariate Cox proportional hazard analysis in NSCLC (n=150)

在對(duì)RASSF1A的大量研究中發(fā)現(xiàn)，RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)極有可能也與腫瘤預(yù)后相關(guān)。RASSF1A甲基化狀態(tài)作為腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)的指標(biāo)在NSCLC中已有證實(shí)。Tomizawes等[11]在對(duì)110例I期肺腺癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，RASSF1A高甲基化與低生存率相關(guān)，并且與腫瘤的低分化程度及血管和胸膜的侵犯高度相關(guān)。Kim等[9]也發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化與I期、II期患者的預(yù)后均有關(guān)（P=0.02,P=0.01）。Endoh等[12]發(fā)現(xiàn)在I期和II期術(shù)后肺癌患者中RASSF1A高甲基化與肺癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)相關(guān)（P=0.024 7）。但是也有1項(xiàng)對(duì)116例NSCLC的研究[13]發(fā)現(xiàn)，RASSF1A的甲基化狀態(tài)除了與腫瘤分化程度（P=0.024）和I期肺癌術(shù)后生存率（P=0.027 6）有關(guān)外，與腫瘤的臨床特征（TNM分期、腫瘤復(fù)發(fā)、淋巴轉(zhuǎn)移和是否吸煙）及II期和III期肺癌術(shù)后生存期均無(wú)關(guān)（P＞0.1）。進(jìn)一步利用Cox回歸模型分析，結(jié)果除了腫瘤分期是腫瘤預(yù)后的危險(xiǎn)因素外（P=0.008 9），其它因素包括RASSF1A甲基化狀態(tài)在內(nèi)均與預(yù)后無(wú)關(guān)。因此RASSF1A甲基化并不能作為一個(gè)理想的肺癌預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)。鑒于存在不同的研究結(jié)果，而國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)RASSF1A異常甲基化在肺癌預(yù)后中的文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)分析150例NSCLC術(shù)后5年生存資料和RASSF1A甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在I期、II期和IIIa期術(shù)后病人中，RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化的病例生存率低于未發(fā)生甲基化的病例，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022,P=0.023,P=0.036）。IIIb-IV期的晚期NSCLC患者是否施行原發(fā)病灶切除需臨床謹(jǐn)慎判斷，本實(shí)驗(yàn)中也選取了21例IIIb-IV期的原發(fā)病灶行手術(shù)切除的NSCLC作為研究對(duì)象，其中RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化和未甲基化的病例生存期比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.118），考慮由于研究例數(shù)較少且晚期肺癌患者后期治療影響因素較多，結(jié)果還有待進(jìn)一步研究。利用Cox模型進(jìn)行多因素分析，將與NSCLC有關(guān)的因素（年齡、性別、組織類型、TNM分期、吸煙指數(shù)、開(kāi)始吸煙年齡等）進(jìn)行預(yù)后相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)除TNM分期外，RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)也是影響NSCLC術(shù)后生存期的一個(gè)獨(dú)立因素（RR=1.584, 95%CI: 1.040-2.411,P=0.032），這一結(jié)果與Tomizawa[11]和Kim等[9]報(bào)道結(jié)果相同。

RASSF1A作為抑癌基因在抑制腫瘤發(fā)生中的作用越來(lái)越來(lái)受到研究者的關(guān)注。不斷有文獻(xiàn)報(bào)道，RASSF1A參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[14-16]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]、穩(wěn)定微管[18,19]等多種細(xì)胞生理功能。但其使RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)發(fā)生變化、引起基因失活的原因尚未完全清楚。本實(shí)驗(yàn)在較多人體肺癌組織標(biāo)本中檢測(cè)RASSF1A啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，分析與肺癌臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)可以作為NSCLC術(shù)后的一個(gè)預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)。