黃寧宇 蘆宏 常麗君 張紅偉 張灝 李冠武

肺腺癌是世界上發(fā)病率和死亡率都很高的癌癥，這主要是由于其具有極強(qiáng)的轉(zhuǎn)移侵襲能力。而轉(zhuǎn)移侵襲的第一步就是分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs），降解細(xì)胞外基質(zhì)[1,2]。因此抑制其分泌MMPs是治療腫瘤的靶點(diǎn)。

白藜蘆醇（Resveratrol, RSV）是一種由植物合成的對(duì)抗外來病原的多酚類化合物，已在多種植物中被發(fā)現(xiàn)。早前研究[3]顯示白藜蘆醇有很好的抗腫瘤生物學(xué)活性和藥理作用，例如可抑制人肺癌、白血病、食管癌、乳腺癌等細(xì)胞的生長(zhǎng)。雖已有人報(bào)道過白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，但尚未見有關(guān)白藜蘆醇抑制肺腺癌侵襲的完整報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以A549細(xì)胞為材料，對(duì)白藜蘆醇抑制其侵襲的作用及機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 白藜蘆醇（Sigma公司，純度99%）用DMSO（二甲基亞砜）溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌，貯存液濃度為500 mmol/L，-20oC避光保存。DMEM培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)（MTT）均購(gòu)自Sigma公司，胎牛血清為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品，Transwell和Matrigel購(gòu)自BD公司，明膠購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，ERK2兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling，PI3K(p85α)兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，p-ERK1/2兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Bioworld，鼠抗人β-actin抗體購(gòu)自Sigma公司，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置37oC、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法測(cè)定白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞的毒性作用 將A549細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔100 μL。實(shí)驗(yàn)組加入白藜蘆醇（0, 10 μmol/L, 20 μmol/L, 30 μmol/L, 40 μmol/L, 50 μmol/L, 75 μmol/L, 100 μmol/L），每組設(shè)6個(gè)平行孔， 同時(shí)設(shè)DMSO對(duì)照組（加入培養(yǎng)液和0.1%DMSO），置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后每孔加入MTT（5 mg/mL）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，然后每孔加入150 μL DMSO，室溫避光震蕩15 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)492 nm波長(zhǎng)OD值，結(jié)果取6個(gè)復(fù)孔的均值。計(jì)算不同濃度白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，從而確定其對(duì)A549細(xì)胞無明顯殺傷的濃度范圍（細(xì)胞活性抑制率大約小于80%）。

1.4 侵襲檢測(cè) 用培養(yǎng)基將Matrigel稀釋為200 μg/mL涂到Transwell的上表面，把A549細(xì)胞濃度調(diào)整到1×106個(gè)/mL，加300 μL到Transwell上室，置培養(yǎng)箱4 h待細(xì)胞貼壁后，加藥如下：①control，②10 ng/mL EGF，③10 ng/mL EGF+10 μM RSV，④10 ng/mL EGF+20 μM RSV（以上均用無血清DMEM配制），Tranwell下室均加上含1%FBS的DMEM。然后置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出，去掉培養(yǎng)基，以棉簽拭去小室濾膜上表面的細(xì)胞，用PBS洗后，將小室置于95%乙醇中固定10 min后再用PBS洗5 min兩次，蘇木素染色2 min-5 min，水洗后倒置于200倍普通顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)的膜下面的細(xì)胞數(shù)。

1.5 明膠酶譜法檢測(cè)不同濃度的白藜蘆醇對(duì)EGF誘導(dǎo)A549分泌MMP-2的抑制效果 先對(duì)A549細(xì)胞如下處理：①control，②10 ng/mL EGF，③10 ng/mL EGF+10 μM RSV，④10 ng/mL EGF+20 μM RSV（以上均用無血清DMEM配制），放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，吸取培養(yǎng)基，用10 kd孔徑的超濾離心管離心（6 000 rpm），每碟培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基由3 mL濃縮為150 μL，取25 μL樣品與相同體積的2×非還原型樣品緩沖液在含有1 mg/mL明膠的10%丙烯酰胺凝膠4oC下電泳2.5 h，洗脫液（2.5%Triton X-100）室溫下洗脫兩次，每次30 min，再用超純水漂洗4次，每次10 min，之后在孵化液（50 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L CaCl2, pH 7.6）孵化48 h，接著在染色液（0.05%考馬斯亮藍(lán)R-250，30%甲醇，10%乙酸）染色2 h，最后用脫色液（20%甲醇，10%乙酸，70%超純水）脫色，得到結(jié)果掃描儲(chǔ)存，以Bio-Rad Quantity One分析。

1.6 Western blot檢測(cè)ERK和PI3K-Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化 收集分別受10 ng EGF、10 ng EGF+20 μM RSV作用不同時(shí)間段（0.5 h, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h）的細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞。加入適量含PMSF、釩酸鈉的RIPA裂解液，于冰上裂解30 min；4oC下10 000 rpm/min離心15 min；取上清，即為細(xì)胞全蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)至NC膜上。10%牛奶封閉非特異抗原，加入一抗[兔抗人p-ERK1/2，ERK2，PI3K(p85α)多克隆抗體，鼠抗人β-actin抗體]4oC反應(yīng)過夜，常溫洗膜后加入二抗，室溫反應(yīng)1 h。用Pierce公司的Supersignal West Dura Extended Duration Substrate ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，將A液與B液等體積混合，配成發(fā)光劑，滴在保鮮膜上，將NC膜倒扣于其上，5 min后用另一保鮮膜將NC膜包裹，X線片壓片，曝光20 s-5 min，顯影2 min，定影2 min。Western blot結(jié)果掃描儲(chǔ)存，以Bio-Rad Quantity One分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及誘導(dǎo)組的組間差異比較采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞活力的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：A549細(xì)胞在0 μM-30 μM白藜蘆醇作用24 h后活力無明顯變化，這表明該濃度范圍的白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞無毒性。而在40 μM-100 μM白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞活力有劑量依賴性的抑制作用（圖1）。

2.2 Transwell小室法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)EGF誘導(dǎo)A549細(xì)胞侵襲的抑制 EGF促進(jìn)A549細(xì)胞侵襲，其侵襲能力增強(qiáng)了

22.9 %，20 μM白藜蘆醇則明顯地抑制其誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲，與E10組相比，其抑制率達(dá)到36.4%。而10 μM白藜蘆醇對(duì)EGF誘導(dǎo)A549細(xì)胞侵襲的抑制作用并不明顯（圖2）。

圖1 MTT法檢測(cè)不同濃度白藜蘆醇作用24 h對(duì)A549細(xì)胞活力的影響柱狀分析圖顯示白藜蘆醇在30 μM內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞沒有明顯毒性。*：與對(duì)照組相比，P＜0.05。Fig 1 A549 cell viability after treatment with Resveratrol at various concentrations for 24 h dectected by MTTThe result reveals that Resveratrol was not toxic to A549 cells at a concentration between 0 to 30 μM.*: compared with the control, P＜0.05.

圖2 10 μM 和20 μM白藜蘆醇對(duì)EGF誘導(dǎo)A549細(xì)胞侵襲的抑制作用A：在200倍倒置顯微鏡拍攝各組侵襲穿透Matrigel的A549細(xì)胞照片；B：細(xì)胞侵襲結(jié)果柱狀分析圖，結(jié)果顯示20 μM白藜蘆醇可有效地抑制EGF誘導(dǎo)的A549細(xì)胞侵襲。*: 與對(duì)照組相比，P＜0.05；#: 與E10組相比，P＜0.05。Fig 2 Effects of 10 μM and 20 μM Resveratrol on EGF-induced A549 cells invasion A: Photos of the A549 cells having penetrated the Matrigel (taken under a microscope with 200-fold ); B: The analysis of A549 cells invasion. It shows that 20 μM Resveratrol inhibited A549 cells’ invasion effectively.*: compared with the control, P＜0.05; #: compared with E10 group, P＜0.05.

圖3 10 μM 和20 μM的白藜蘆醇對(duì)EGF誘導(dǎo)A549分泌MMP-2的抑制作用A：明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2活性；B：柱狀分析圖表明20 μM 白藜蘆醇有效地抑制EGF誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中MMP-2的活性。*：與對(duì)照組相比，P＜0.05；#：與E10組相比，P＜0.05。Fig 3 Inhibitory effects of 10 μM and 20 μM Resveratrol on the MMP-2 activity of A549 cells stimulated by EGFA: The activity of MMP-2 determined by gelatine zymography; B: The densitometric analysis reveals that the activity of MMP-2 of EGF-induced A549 cells was inhibited significantly by 20 μM Resveratrol.*: compared with the control, P＜0.05; #: compared with E10 group, P＜0.05.

圖4 20 μM白藜蘆醇對(duì)p-ERK1/2和PI3K(p85α)的抑制作用A：EGF和EGF+RSV作用不同時(shí)間段（0.5 h，1 h，2 h，3 h和6 h）后，A549細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2和PI3K(p85α)的Western blot檢測(cè)結(jié)果，以β-actin和ERK2作為內(nèi)參；B和C：p-ERK1/2和PI3K(p85α)含量變化的柱狀分析圖；結(jié)果顯示20 μM白藜蘆醇在多個(gè)時(shí)間段內(nèi)抑制p-ERK1/2和PI3K(p85α)。*：與對(duì)照組相比，P＜0.05；#：與同時(shí)段E10組相比，P＜0.05。Fig 4 Inhibitory effects of 20 μM Rresveratrol on p-ERK1/2 and PI3K(p85α)A: The expressions of p-ERK1/2 and PI3K(p85α) detected by Western blot,the A549 cells were treated respectively with 10 ng EGF and 10 ng EGF +20 μM RSV for various periods of time (0.5，1，2，3 and 6 h) , β-actin and ERK2 served as internal control; B & C: The densitometric analysis of p-ERK1/2 and PI3K(p85α) shows that 20 μM Resveratrol suppressed p-ERK1/2 and PI3K(p85α) in several periods of time.*: compared with the control, P＜0.05; #: compared with the E10 group of the same time period, P＜0.05.

2.3 明膠酶譜法檢測(cè)白藜蘆醇抑制EGF誘導(dǎo)A549細(xì)胞分泌MMP-2 EGF 促進(jìn)A549細(xì)胞分泌MMP-2，其分泌量比對(duì)照組增加了38.6%，10 μM和20 μM白藜蘆醇對(duì)EGF誘導(dǎo)A549分泌MMP-2均有抑制作用，其中20 μM白藜蘆醇效果明顯，與E10組相比，其抑制率達(dá)到49.3%（圖3）。2.4 20 μM白藜蘆醇在不同時(shí)間段對(duì)p-ERK1/2和PI3K的抑制 EGF均促進(jìn)了A549細(xì)胞中ERK1/2和PI3K的活性，其中對(duì)ERK1/2更為顯著，特別是在2 h時(shí)段，ERR1/2磷酸化程度最高。對(duì)比同時(shí)段的EGF誘導(dǎo)組，在1 h、2 h、3 h、6 h中，20 μM白藜蘆醇在每個(gè)時(shí)間段中都抑制ERK1/2的磷酸化，類似地，從1 h開始的各個(gè)時(shí)間段，20 μM白藜蘆醇處理組與同時(shí)段的EGF誘導(dǎo)組相比，PI3K含量明顯下降。（圖4）。

3 討論

白藜蘆醇是一種純天然小分子化合物，生物作用廣泛，近年來其抗癌作用一直受到全世界研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。研究集中在白藜蘆醇對(duì)腫瘤的起始、增殖、發(fā)生、轉(zhuǎn)移各個(gè)階段的抑制和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并已發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種腫瘤作用明顯。另一方面，白藜蘆醇毒副作用小，是一種比較理想抗腫瘤物質(zhì)。我們通過MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在30 μM之內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性，據(jù)此確定用該濃度范圍的白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞的侵襲抑制進(jìn)行檢測(cè)。

EGF是一種重要的細(xì)胞因子，對(duì)細(xì)胞的增殖、黏附、轉(zhuǎn)移等起著促進(jìn)作用。經(jīng)過多次試驗(yàn)摸索，我們確定10 ng/mL的EGF能明顯增強(qiáng)A549細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，因此以其作為實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)劑。

惡性腫瘤侵襲周圍組織分為三個(gè)獨(dú)立步驟：對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的降解、細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖[4]。MMPs的過度分泌在侵襲的過程中起著關(guān)鍵的作用，腫瘤細(xì)胞通過其對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行降解，突破周圍組織的限制。之前的文獻(xiàn)大多只關(guān)注藥物對(duì)A549過度分泌MMP-2抑制，而不是MMP-9。此外，也有文獻(xiàn)[5]報(bào)道MMP-2和MMP-9在非小細(xì)胞肺癌中均會(huì)對(duì)基底膜有破壞作用，我們經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞主要分泌MMP-2，而MMP-9相對(duì)很少，同時(shí)白藜蘆醇也只對(duì)MMP-2起抑制作用，而對(duì)MMP-9沒有明顯的抑制（未發(fā)表資料），因此我們?cè)诒狙芯恐兄魂P(guān)注MMP-2的變化。那么白藜蘆醇為什么只抑制MMP-2，而不抑制MMP-9？有關(guān)的研究正在進(jìn)行，如發(fā)現(xiàn)有意義的結(jié)果將另文發(fā)表。計(jì)算EGF誘導(dǎo)組和白藜蘆醇處理組中A549細(xì)胞侵襲穿透涂有Matrigel小濾膜的細(xì)胞數(shù)目（Transwell小室法），可以得出，EGF促進(jìn)了細(xì)胞侵襲，而白藜蘆醇抑制了這種誘導(dǎo)的侵襲，20 μM白藜蘆醇抑制侵襲的效果明顯，比EGF誘導(dǎo)組減少36.4%。明膠酶譜法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)20 μM白藜蘆醇可有效地減少EGF誘導(dǎo)A549分泌MMP-2，比誘導(dǎo)組MMP-2的分泌量減少了49.3%，從而降低了分解、穿透Matrigel的能力，這進(jìn)一步證實(shí)了之前Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

EGF對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用一般認(rèn)為主要通過ERK通路或PI3K-Akt通路[6-10]。這兩條信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、粘附和基質(zhì)金屬蛋白酶分泌與降解等轉(zhuǎn)移因素密切相關(guān)。其機(jī)制可能是：EGF與表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）結(jié)合，EGFR發(fā)生二聚化和自身磷酸化，為帶有SH2或PTB結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)信號(hào)蛋白分子如Shc、Grb-2、Gab1等提供結(jié)合位點(diǎn)。Shc和Grb2聚集到酪氨酸磷酸化的受體上后，鳥苷酸交換因子Sos結(jié)合Grb2，活化Ras蛋白，接著通過Ras-Raf-MEK途徑將ERK1/2磷酸化為p-ERK1/2，活化的p-ERK1/2后進(jìn)入核內(nèi)作用轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和c-Jun，上調(diào)MMP基因的表達(dá)[6,11-14]。同時(shí)，結(jié)合到EGFR的Gab1也被活化，其C-端特定酪氨酸磷酸化后成為PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85的結(jié)合位點(diǎn)，招募大量的PI3K，在EGF的刺激下PI3K催化PIP2磷酸化形成第二信使PIP3，PIP3促使PDK1磷酸化Akt蛋白的Ser308導(dǎo)致Akt的活化?；罨腁kt能提高腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力、降低細(xì)胞間的粘附力、增加核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB通的活性和MMP的分泌，從而促進(jìn)細(xì)胞侵襲[6,10,15]。

因此，對(duì)ERK通路和PI3K-Akt通路的抑制或者阻斷是降低A549細(xì)胞侵襲的重要途徑。本研究初步探究白藜蘆醇抑制EGF誘導(dǎo)的A549細(xì)胞侵襲的機(jī)制，即用Western blot檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)A549細(xì)胞中ERK1/2和PI3K活化的抑制效果。

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：EGF誘導(dǎo)A549細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2磷酸化在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到很高水平（0.5 h-2 h），之后降低，20 μM白藜蘆醇能在各個(gè)時(shí)間段明顯地抑制ERK1/2的磷酸化，尤其是在2 h時(shí)間段抑制最為明顯，同時(shí)檢測(cè)了ERK2總量，發(fā)現(xiàn)基本未發(fā)生變化，說明白藜蘆醇確實(shí)可抑制p-ERK的表達(dá)即ERK1/2的磷酸化。同樣，白藜蘆醇也在大多數(shù)時(shí)間段中抑制了PI3K，說明白藜蘆醇對(duì)ERK通路和PI3K-Akt通路均起到了抑制作用。

綜合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，我們可以得出：20 μM白藜蘆醇能夠有效地抑制EGF誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的侵襲，其機(jī)制可能是通過抑制EGFR通路中ERK1/2的磷酸化和PI3K活性，從而降低A549細(xì)胞分泌MMP-2，最終抑制其細(xì)胞侵襲。