王士勇 杜微麗 張暉 烏蘭圖雅 張遠(yuǎn) 何英 楊云鋒 劉颯 張哲 王佳玲

近年來(lái)，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cells, CIK）因其增殖速度快、溶瘤活性高、溶瘤譜廣及對(duì)多重耐藥腫瘤細(xì)胞敏感等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用[1-4]。傳統(tǒng)培養(yǎng)CIK細(xì)胞方法需要較高的基礎(chǔ)細(xì)胞數(shù)，需用血細(xì)胞分離機(jī)分離外周血、提取單個(gè)核細(xì)胞，繁瑣耗時(shí)，污染機(jī)會(huì)大，特別不適宜異體供血。如何簡(jiǎn)化培養(yǎng)過(guò)程，提高CIK細(xì)胞在體外增殖效率和細(xì)胞毒活性是基礎(chǔ)研究的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。重組人纖維連接蛋白（recombinant human fibronectin, RN）參與淋巴細(xì)胞的附著、伸展、分化和增殖[5]。本研究初步探討RN誘導(dǎo)法與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法在促進(jìn)CIK細(xì)胞體外增殖能力、提高主要效應(yīng)細(xì)胞含量、增強(qiáng)細(xì)胞毒活性等方面的優(yōu)缺點(diǎn)，以期建立更加適合臨床應(yīng)用的CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 人肺癌細(xì)胞系及培養(yǎng) 肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549（腺癌）、SPC-A1（腺癌）、CH27（鱗癌）和H460（大細(xì)胞癌）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物、試劑及主要儀器 抗人CD3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BD Pharmigen公司；rhIFN-γ購(gòu)自美國(guó)Pepro Techinc公司；rhIL-1購(gòu)自美國(guó)Biosource公司；重組人IL-2為山東泉港藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；RN、無(wú)血清培養(yǎng)液KBM551、RPIM-1640培養(yǎng)液為日本寶生物公司產(chǎn)品；佛波酯、離子霉素、莫能霉素、破膜劑、溶血素、三色試劑盒CD8-FITC/CD4-PE/CD3-PC5及CD3-FITC/CD56-PE/CD16-PC5、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-4）測(cè)定試劑盒、FITC-抗穿孔素、PE-抗顆粒酶、APC-抗CD8熒光抗體均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司生產(chǎn)，型號(hào)FC 500 MPL。

1.3 CIK細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增及存活率測(cè)定 抽取10例健康人（男、女各5例，年齡37歲-57歲）外周靜脈血每人50 mL，用淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），每份血樣的PBMCs均分為2份，采用2種方法誘導(dǎo)培養(yǎng)，即RN誘導(dǎo)組和傳統(tǒng)方法組。RN誘導(dǎo)組采用新培養(yǎng)方法：即用RN（25 μg/mL）和抗CD3 mAb（5 μg/mL）提前24 h包被培養(yǎng)瓶，以后培養(yǎng)體系中只加入IL-2（1 000 U/mL）和KBM551無(wú)血清培養(yǎng)基。傳統(tǒng)方法組：提前24 h用抗CD3 mAb（5 μg/mL）包被培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)當(dāng)天加入重組人IFN-γ（1 000 U/mL）、IL-1α（500 U/mL）、IL-2（1 000 U/mL），以后僅加入IL-2（1 000 U/mL）和KBM551無(wú)血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件是在37oC、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3天用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率，記錄細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。

1.4 淋巴細(xì)胞免疫表型檢測(cè) 分別取培養(yǎng)第0、7、14、21天樣品6 mL，離心后用PBS洗滌2遍，按照BD公司試劑盒說(shuō)明書(shū)染色，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD16+CD56+細(xì)胞的百分比。

1.5 CIK細(xì)胞體外殺瘤率測(cè)定 采用MTT法，選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述4種肺癌細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×104/mL，于96孔板中每孔加入100 μL，37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取培養(yǎng)第15天的CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，按效:靶比20:1和40:1加入CIK細(xì)胞，設(shè)效應(yīng)細(xì)胞殺傷組、效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組、腫瘤細(xì)胞對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。共同培養(yǎng)48 h后加入2.5 mg/mL MTT溶液40 μL后再培養(yǎng)4 h。離心棄上清，加入150 μL DMSO溶液震蕩混勻，酶標(biāo)儀選擇570 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔光密度值（optical density, OD），計(jì)算殺瘤率，計(jì)算公式為：殺瘤率（%）=1-[（殺傷組OD值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值）/腫瘤細(xì)胞對(duì)照組OD值]×100%。

1.6 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子、穿孔素和顆粒酶檢測(cè) 取培養(yǎng)第15天的CIK細(xì)胞懸液0.5 mL，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL，經(jīng)佛波酯、離子霉素激活、莫能霉素阻斷4 h，加入APC熒光標(biāo)記的抗CD3 mAb，室溫、避光15 min標(biāo)記細(xì)胞膜表面分子；而后加入破膜劑和抗IFN-γ、IL-4、穿孔素、顆粒酶B等熒光標(biāo)記的單克隆抗體，室溫、避光30 min后，用PBS洗去多余的抗體，用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD3+細(xì)胞中表達(dá)IFN-γ、IL-4、穿孔素、顆粒酶B的細(xì)胞的陽(yáng)性率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)結(jié)果用Mean±SD表示，雙側(cè)t檢驗(yàn)比較兩組均數(shù)的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法誘導(dǎo)CIK細(xì)胞的增殖活性與存活率 RN誘導(dǎo)組和傳統(tǒng)方法組的CIK細(xì)胞均表現(xiàn)出非常高的增殖活性（見(jiàn)圖1），從起始細(xì)胞數(shù)的（2.35±1.13）×107，至第22天達(dá)高峰，CIK細(xì)胞數(shù)分別達(dá)到（750.00±109.23）×107和（343.00±188.70）×107；而且，從培養(yǎng)第7天-第28天，RN法高出傳統(tǒng)法2倍-3.5倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。檢測(cè)RN誘導(dǎo)組和傳統(tǒng)方法組的CIK細(xì)胞存活率，第15天分別為（97.71±1.07）%和（95.48±2.01）%，第21天分別為（92.23±2.28）%和（90.85±5.28）%，存活率都在90%以上。

2.2 RN誘導(dǎo)CIK細(xì)胞免疫表型的變化 隨著體外培養(yǎng)天數(shù)的增加，RN誘導(dǎo)組和傳統(tǒng)方法組CD3+細(xì)胞比例均上調(diào)（見(jiàn)表1和圖2，傳統(tǒng)方法組流式結(jié)果圖未給出），至第21天，分別達(dá)到（97.08±2.14）%和（97.22±2.25）%，CD3+CD4+細(xì)胞比例分別下降至（15.31±8.49）%和（18.79±6.84）%，CD3+CD8+細(xì)胞比例分別上升到（76.26±8.60）%和（66.79±9.52）%；CD3+CD16+CD56+細(xì)胞比率也上升，由初始（1.83±0.212）%分別上升到（26.01±7.68）%和（31.32±7.34）%，且絕對(duì)數(shù)分別增加了3 778倍和2 069倍。與傳統(tǒng)方法組比較，RN組顯著增加了CD3+CD8+細(xì)胞的比率，在第14天增幅達(dá)高峰，為（77.30±6.72）%，顯著高于傳統(tǒng)方法組（68.31±8.87）%（P=0.02），直到第21天CD3+CD8+細(xì)胞仍然保持較高的比率，分別為（76.26±8.61）%和（66.79±9.52）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042）；RN組對(duì)CD3+CD4+細(xì)胞比例的影響，與傳統(tǒng)方法組相比，第7、14、21天在數(shù)量上相似（P＞0.05）。另外，RN誘導(dǎo)組的CD3+CD16+CD56+細(xì)胞比例低于傳統(tǒng)方法組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，第7、14、21天P值分別為0.389、0.439、0.153，均大于0.05。而且，由于RN誘導(dǎo)組第7天-第21天細(xì)胞總數(shù)明顯高于傳統(tǒng)方法組，故CD3+CD16+CD56+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)較高。

2.3 CIK細(xì)胞體外殺瘤率的比較 RN誘導(dǎo)組和傳統(tǒng)方法組的CIK細(xì)胞，對(duì)4種肺癌細(xì)胞株體外殺瘤率比較，在同一效:靶比水平上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。但將2種培養(yǎng)方法誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞數(shù)量增加時(shí)，效:靶比40:1組的殺瘤率均明顯高于效靶比20:1組（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 RN組CIK細(xì)胞的細(xì)胞因子、穿孔素和顆粒酶B的檢測(cè) RN誘導(dǎo)的第15天CIK細(xì)胞，分泌IFN-γ的細(xì)胞比例增加，從誘導(dǎo)前24.89%增加至58.76%；分泌IL-4的細(xì)胞比例變化不大，從誘導(dǎo)前2.16%下降到0.53%（圖3）；釋放顆粒酶B、穿孔素的細(xì)胞也呈陽(yáng)性（圖4），誘導(dǎo)前為陰性。

圖1 2種培養(yǎng)方法誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞的增殖能力Fig 1 Proliferation ability of CIK cells cultured by two methods RN: recombinant human fibronectin.

圖2 RN誘導(dǎo)法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞中各亞群比例隨培養(yǎng)天數(shù)的變化Fig 2 The ratio changes of the CIK cells subsets cultured by RN

圖3 RN誘導(dǎo)前后分泌IFN-γ和IL-4細(xì)胞的陽(yáng)性率Fig 3 The positive rate of cells secreting IFN-γ and IL-4 in CIK cells cultured by RN

圖4 RN誘導(dǎo)后的CIK細(xì)胞穿孔素、顆粒酶B的陽(yáng)性率Fig 4 The positive rates of cells secreting perforin and granzyme B in CIK cells cultured by RN

表1 RN誘導(dǎo)法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞中各亞群比例隨培養(yǎng)天數(shù)的變化Tab 1 The ratio changes of the CIK cells subsets cultured by RN

表2 兩種方法誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞殺瘤率比較（%）Tab 2 The inhibition rate of CIK cells cultured by two methods (%)

3 討論

RN是重組人纖維連接蛋白片段，包括細(xì)胞結(jié)合域、肝磷脂結(jié)合域和CS1位點(diǎn)三個(gè)功能區(qū)域，由574個(gè)氨基酸組成，分子量為63 kDa。其生理活性為參與淋巴細(xì)胞的附著、伸展、分化和增殖。RN和抗CD3抗體可分別與T淋巴細(xì)胞上的VLA和TCR結(jié)合，兩者共同作用激活酪氨酸激酶pp125FAK，然后通過(guò)Ras途徑刺激T細(xì)胞的增殖和分化[5]。本實(shí)驗(yàn)中新引入了RN，并首次系統(tǒng)地進(jìn)行了生物學(xué)特性的研究，獲得了比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法更高的促淋巴細(xì)胞增殖效果，從細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量上保證了CIK細(xì)胞回輸治療。新培養(yǎng)方法采用抽取50 mL外周靜脈血的方式代替血細(xì)胞分離機(jī)，減少了對(duì)供體免疫功能的影響和感染機(jī)會(huì)；以RN替代了IFN-γ和IL-1α，降低了總成本。

本研究結(jié)果顯示，健康人外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)特定的細(xì)胞因子誘導(dǎo)及體外擴(kuò)增培養(yǎng)后，CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD56+CD16+細(xì)胞比例較培養(yǎng)前明顯增加，CD3+CD4+及CD3+CD4+與CD3+CD8+的比值則明顯降低，即殺傷性T細(xì)胞比例增加，輔助性T細(xì)胞減少。CD8+T細(xì)胞是一群異質(zhì)性的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)刺激后“原始”CD8+T細(xì)胞能增殖、分化為效應(yīng)性T細(xì)胞或記憶性T細(xì)胞。效應(yīng)性T細(xì)胞可通過(guò)分泌穿孔素、顆粒酶等物質(zhì)直接殺傷靶細(xì)胞，但其增殖能力弱，一旦機(jī)體內(nèi)抗原的濃度減低或消退后效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量急劇減少。記憶性CD8+T細(xì)胞經(jīng)初次抗原反應(yīng)后能存活較長(zhǎng)時(shí)間，若再次受到相同抗原刺激它能迅速地被活化并分泌大量的細(xì)胞因子。有研究[6-8]結(jié)果說(shuō)明培養(yǎng)后CD8+T細(xì)胞是以記憶性細(xì)胞而不是以“原始”細(xì)胞為主，使得培養(yǎng)后的細(xì)胞具有一定的增殖潛能，更有利于機(jī)體的抗腫瘤反應(yīng)。表面標(biāo)記為CD3+CD56+CD16+的細(xì)胞被認(rèn)為是CIK細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞，在體外擴(kuò)增過(guò)程中可擴(kuò)增至2 000倍以上。以往研究[9]表明CD3+CD56+CD16+細(xì)胞80%以上來(lái)源于CD8+殺傷性T細(xì)胞，理論上講伴隨CD3+CD8+細(xì)胞的增多，在回輸至患者體內(nèi)后轉(zhuǎn)化為CIK細(xì)胞的比例也會(huì)增加。

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)證實(shí)CIK細(xì)胞對(duì)多種肺癌細(xì)胞株都具有較強(qiáng)的殺傷力，其殺傷活性隨著效應(yīng)細(xì)胞比例的增大而增加。RN誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞與傳統(tǒng)方法獲得的CIK細(xì)胞對(duì)同一種瘤細(xì)胞的殺傷活性相當(dāng)。

本研究初步探討了CIK細(xì)胞的殺瘤機(jī)理。健康人PBMCs經(jīng)體外RN誘導(dǎo)后的CIK細(xì)胞遇到抗原刺激很快被激活并分化為具有細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞，分泌Th1型細(xì)胞因子IFN-γ，高表達(dá)TNF-α、Perforin等細(xì)胞壞死相關(guān)因子，幾乎不分泌Th2型細(xì)胞因子IL-4，因而在免疫應(yīng)答中傾向于Th1優(yōu)勢(shì)。

RN誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，具有更強(qiáng)的體外增殖能力，增加了殺傷性T淋巴細(xì)胞的比例，并且可能帶來(lái)提高遠(yuǎn)期殺瘤活性的優(yōu)勢(shì)。其體外殺瘤活性與傳統(tǒng)誘導(dǎo)方法作用相當(dāng)。分泌殺傷性細(xì)胞因子、釋放顆粒酶、穿孔素的水平較激活前明顯增多。此外新培養(yǎng)方法所需血量少，對(duì)供體免疫功能影響小，使用無(wú)血清培養(yǎng)基減少了外源感染的機(jī)會(huì)；在我們的臨床應(yīng)用研究中，RN誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞單獨(dú)或與化療等其它治療方法聯(lián)合應(yīng)用，表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，抽血時(shí)間方便，不受病人的狀態(tài)和治療的影響，增加病人的抵抗力、體力，延長(zhǎng)了病人的生存期[10]，值得推廣應(yīng)用。