趙廷昌, 時 濤, 李國慶, 孫福在

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193;2.華中農(nóng)業(yè)大學植物科技學院,武漢 430070)

番茄細菌性斑點病[Pseudomonassyringae pv.tomato(Okabe)Young,Dye&Wilkie]是一種世界性病害,發(fā)生危害遍及世界各大洲,可造成5%～75%的產(chǎn)量損失,嚴重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。自1933年首次發(fā)現(xiàn)以來,該病在美國、前蘇聯(lián)、意大利等國都有發(fā)生報道,在我國,以前只有臺灣省有發(fā)生報道,近年來在東北和內(nèi)蒙古、新疆等地普遍發(fā)生,嚴重影響當?shù)氐姆焉a(chǎn)[2]。

研究表明,抗病番茄品種帶有抗病基因Pto,病原物丁香假單胞桿菌番茄致病變種[Pseudomonas syringae pv.tomato(Okabe)Young,Dye and Wilkie](PST)帶有無毒基因avrPto。感病番茄品種則因缺少抗病基因而不能產(chǎn)生對細菌性斑點病的抗性。感病番茄雖然不攜帶抗病基因,但是常常帶有抗病基因的同源序列。作者在對番茄Pto基因家族成員之一LescPtoF進行研究時,發(fā)現(xiàn)我國的3個感細菌性斑點病的番茄品種也帶有該基因的同源序列。以下是主要研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

感病番茄品種中蔬4號,mr和美國大紅櫻桃由中國農(nóng)科院蔬菜所提供。大腸桿菌菌株JM109購自Promega公司。PCR片段回收試劑盒和克隆載體pMD18-T購自寶生物公司。其他藥品和試劑購自上海生工生物有限技術(shù)公司。

1.2 引物的合成和PCR擴增

根據(jù)已報道LescPtoF基因編碼區(qū)序列設計如下1對引物:引物 1(+):5′ATG GGA AGC AAG TAT TCC AAG GC 3′,引物 2(-):5′CT T AAA TAA CAG ACT CT T GGA GAC G 3′。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

采用CTAB法從幼嫩番茄葉片中提取基因組DNA。PCR擴增采用25 μ L反應體系,其中含10倍PCR 緩 沖 液 2.5 μ L,10 mmol/L dNTP 1 μ L,10 μ mol/L各引物溶液 1 μ L,模板 DNA 20 ～100 ng,Taq plus I DNA 聚合酶0.5 μ L(2.5U/μ L),加去離子水至25 μ L。循環(huán)反應條件設置為94℃30 s、55℃30 s、72℃2 min,循環(huán)35次;最后在 72℃延伸10 min。

1.3 序列測定和分析

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度1%瓊脂糖凝膠電泳分離。切膠后用 TaKaRa Biotech公司提供的PCR片段回收試劑盒進行回收純化,純化產(chǎn)物連接到克隆載體pMD18-T上,膠回收和純化產(chǎn)物連接克隆載體均按照試劑盒說明書進行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,選用pMD18-T載體多克隆位點兩側(cè)的HindIII和EcoRI切點對獲得的轉(zhuǎn)化子克隆質(zhì)粒進行雙酶切鑒定,鑒定出正確的轉(zhuǎn)化子克隆后每個樣品挑3個陽性克隆,由上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序。測序結(jié)果在http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上比對后確認每個樣品的序列,與已經(jīng)報道的LescPtoF基因進行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LescPtoF基因同源序列的PCR擴增

以3個感病番茄品種中蔬4號、mr和美國大紅櫻桃的基因組DNA為模板,進行PCR擴增都獲得1條大小約為1 kb的DNA產(chǎn)物片段(圖1)。

圖1 感病番茄品種PCR擴增結(jié)果

3個番茄品種的PCR擴增產(chǎn)物回收后,連接pMD18-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109。用 Hin dIII和EcoRI對轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進行雙酶切鑒定,陽性轉(zhuǎn)化子會產(chǎn)生2條帶(約2.7 kb載體帶和約1.0 kb目的片段),部分陽性轉(zhuǎn)化子酶切結(jié)果見圖2。每個樣品挑3個克隆測序后經(jīng)過比對確認各樣品的序列,分別命名為ZS、MR和MH。

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.2 所獲克隆的序列測定和分析

測序結(jié)果表明3個序列的長度均為963 nt,在http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上與已經(jīng)報道的LescPtoF基因進行比較分析。結(jié)果表明,ZS和MR序列和已報道的LescPtoF基因序列完全一致,MH的相似性為99%。

3 討論

農(nóng)作物病害嚴重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì),利用抗病品種是最有效的防治措施之一。理論上,寄主植物有多個抗病基因而病原物有多個無毒基因,這些抗病基因和無毒基因之間是相互對應的,每一個抗病基因都只能和對應的無毒基因互作而產(chǎn)生抗病反應。1993年Martin等[3]利用圖譜克隆法從野生番茄品種中克隆到了番茄抗細菌性斑點病基因pto,隨后,Buonaurio等[4]報道在意大利帶有pto基因的番茄上發(fā)現(xiàn)1號小種侵染。Pilowsky等[5]研究表明番茄品種PI126430的抗PST基因與Pto不同,他將其命名為Pto2。隨后Stockinger等[6]又在多毛番茄無毛變種中克隆出另外 2個抗PST的基因Pto3(抗0號小種)和Pto4(抗1號小種)。這些結(jié)果表明抗病基因 pto以及對應的無毒基因avr-Pto都不是唯一的。

Pto基因的蛋白產(chǎn)物是一種親水的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,和無毒基因avrPto的蛋白相互識別后,和Pti類蛋白互作,通過一系列的酶促級聯(lián)反應,調(diào)控番茄產(chǎn)生對細菌性斑點病的抗性。在Pto基因調(diào)控的這一級聯(lián)反應如果有其他相關(guān)基因缺陷而造成級聯(lián)反應被破壞,同樣也不能產(chǎn)生抗病反應。Jia Yulin等[7]報道在感斑點病和倍硫磷不敏感的番茄品種中存在 pto的等位基因,等位基因得到分離和特性測定,編碼活性蛋白激酶,和pto相比,氨基酸序列相似性為87%。2002年Chang等發(fā)現(xiàn)感病番茄品種VFNT Cherry的Pto基因家族成員之一LescPtoF編碼的蛋白質(zhì)具有激酶活性,并且在轉(zhuǎn)基因煙草中可以特異地識別AvrPto,并對Pst具有微效抗性,引起煙草細胞壞死,表明該基因引起的酶促級聯(lián)反應因番茄中某個必需基因被破壞而產(chǎn)生的。本研究根據(jù)LescPtoF基因的編碼區(qū)設計引物,從3個感細菌性斑點病的番茄品種上都分離出和該基因幾乎完全一致的序列,表明這3個番茄品種存在著Pto基因的同源序列。這3個番茄品種沒有抗性的原因,可能和VFNT Cherry一樣由于該基因引發(fā)的級聯(lián)反應不能完全進行而造成的,這些還需要進行進一步的研究來證實。

[1] Yunis H,Bashan Y,Okon Y,et al.Chemical control of bacterial speck of tomato and its effect on tomato yield[J].Hassadeh,1980,60(5):1004-1007.

[2] 趙廷昌,于莉,孫福在,等.番茄細菌性斑點病及其防治[J].植物保護,1999,25(4):56.

[3] Martin G B,Brommonschenkel S H,Chunwongse J.Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistant in tomato[J].Science,1993,262:1432-1436.

[4] Buonaurio R,Stravato V M,Cappelli C.Occurrence of Pseudomonas syringae pv.tomato race 1 in Italy on Pto gene-bearing tomato plants[J].Journal of Phytopathology,1996,144:9-10,437-440.

[5] Pilowsky M,Zutra D.Reaction of different tomato genotypes to the bacterial speck pathogen(Pseudomonas syringae pv.tomato)[J].Phytoparasitica,1986,14(1):39-42.

[6] Stockinger E J,Walling L L.Pto3 and Pto 4:novel genes from Lycopersicon hirsutum var.glabratum that confer resistance to Pseudomonas syringae pv.tomato.[J].T heoretical and Applied Genetics,1994,89:(7/8):879-884.

[7] Jia Yulin,Loh YingT su,Zhou Jianmin,et al.Alleles of Pto and Fen occur in bacterial speck-susceptible and fenthion-insensitive tomato cultivars and encode active protein kinases[J].Plant Cell,1997,9(1):61-73.

[8] Chang J H,T ai Y S,Bernal A J,et al.Functional analyses of the Pto resistance gene family in tomato and the identification of a minor resistance determinant in a susceptible haplotype[J].M ol Plant Microbe Interact,2002,15(3):281-291.