王 蕊, 羅來(lái)鑫, 李健強(qiáng)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系,農(nóng)業(yè)部植物病理學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

番茄潰瘍病是一種嚴(yán)重危害番茄生產(chǎn)的細(xì)菌性病害,普遍發(fā)生在世界各大番茄主產(chǎn)區(qū)[1-2]。美國(guó)、加拿大、意大利、英國(guó)、土耳其等番茄生產(chǎn)大國(guó)均有報(bào)道,成為制約當(dāng)?shù)胤焉a(chǎn)的重要因素。該病害病原菌為密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)(以下簡(jiǎn)稱Cmm)。我國(guó)在北京、黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、新疆、河北、山西、山東、上海、海南等地都有番茄潰瘍病的發(fā)生和危害[3-4],使番茄制種及大田生產(chǎn)受到不同程度的影響。目前,國(guó)際上對(duì)番茄潰瘍病的研究多集中在病原菌致病基因表達(dá)、病害防治等方面[5],關(guān)于不同來(lái)源的病原菌致病力差異方面報(bào)道很少;我國(guó)亦尚無(wú)研究進(jìn)展報(bào)道。研究不同來(lái)源番茄潰瘍病菌的致病力差異,是探索該病菌多態(tài)性以及開(kāi)展致病機(jī)制等其他相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外關(guān)于包括番茄潰瘍病菌在內(nèi)的植物病原細(xì)菌的接種方法已報(bào)道有剪葉法、浸根法和針刺法等[6]。作者在2004年報(bào)道使用打頂法進(jìn)行番茄潰瘍病菌的接種[7],簡(jiǎn)單易行,結(jié)果可靠[8],可以作為研究大量不同菌株致病力差異的方法。

本文以46株來(lái)源于3個(gè)國(guó)家不同地區(qū)的番茄潰瘍病菌為研究材料,采用打頂法接種2～3葉期番茄幼苗,通過(guò)調(diào)查病情指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)不同菌株的致病力強(qiáng)弱,并利用半選擇性培養(yǎng)基分離和特異性PCR等方法,對(duì)來(lái)自發(fā)病幼苗的分離物進(jìn)行了驗(yàn)證,證實(shí)來(lái)自于病株的分離物均為原接種的番茄潰瘍病菌。結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供試番茄品種為佳粉10,為我國(guó)華北的主栽品種。育苗基質(zhì)按V(菜田土)∶V(草炭)∶V蛭石=1∶1∶1的比例配制,經(jīng)160℃干熱滅菌5 h,冷卻后裝入72穴(6行×12列)育苗盤(pán)中,用水充分浸潤(rùn)基質(zhì)24 h,隨后播種番茄種子,每穴2～3粒,在溫室中(日平均氣溫為26℃左右,夜間最低溫度控制在15～18℃,白天最高溫度為32～35℃;相對(duì)濕度控制在30%～60%,日平均相對(duì)濕度為42%)育苗;播種后7～10 d間苗,每穴選留1株長(zhǎng)勢(shì)均勻健壯的幼苗,培育至2～3片真葉期供接種用。

1.1.2 供試菌株

供試菌株包括作者所在研究室不同年份分離自我國(guó)不同地區(qū)番茄潰瘍病發(fā)病田植株并經(jīng)特異性PCR驗(yàn)證初步鑒定為Cmm的菌株,以及與國(guó)內(nèi)外同行交換或接受饋贈(zèng)獲得的共計(jì)46株,具體信息見(jiàn)表1。

表1 供試菌株基本信息

1.1.3 培養(yǎng)基

YDC培養(yǎng)基:10 g酵母提取物、20 g CaCO3超微粉(Sigma,No.C-6763)、20 g葡萄糖、15 g瓊脂、去離子水1000 mL,121℃滅菌 20 min,冷卻至50℃后制備平板備用。

mSCM 培養(yǎng)基:2.62 g K2HPO4?3H2O、0.5 g MgSO4?7H2O 、1.5 g硼酸 、10 g 甘露糖、0.1 g 酵母提取物、15 g瓊脂溶于980 mL蒸餾水中,滅菌后加入100 mg煙酸(溶于20 mL無(wú)菌水)、30 mg萘啶酮酸鈉鹽(溶于1 mL 0.1 mol/L NaOH)、200 mg放線菌酮(溶于1 mL無(wú)水甲醇)。

LB液體培養(yǎng)基:酵母提取物5 g,胰蛋白胨(tryptone)10 g,氯化鈉5 g,去離子水1000 mL。

1.1.4 引物

選取Luo[9]等設(shè)計(jì)的Cmm特異性引物spm 4f/2r進(jìn)行分離物的PCR鑒定。

序列如下 :spm 4f 5′-TCAGGCGTCTGT TCTGGC-3′和 spm 2r 5′-CCCACCACCATCCACAAC-3′,由北京三博遠(yuǎn)志公司合成。

1.2 研究方法

1.2.1 接種體的制備

將凍存于-86℃超低溫冰箱的Cmm菌株于YDC培養(yǎng)基平板上進(jìn)行活化,活化好的菌株在YDC培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h后,挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中搖培24 h,通過(guò)平板計(jì)數(shù)法確定菌液濃度達(dá)到109cfu/mL后備用。

1.2.2 接種方法

采用作者2004年報(bào)道的打頂法進(jìn)行接種。即使用14 cm手術(shù)剪(型號(hào):PT J-3)的前端1 cm蘸取菌懸液后在番茄幼苗子葉上部1～2 cm處將主莖剪斷,每株菌株的接種處理設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)接種5株番茄幼苗,以無(wú)菌水為空白對(duì)照。接種幼苗在1.1.1所述溫室中培養(yǎng),適時(shí)澆水保證秧床土壤濕潤(rùn)。接種后21 d,調(diào)查記錄發(fā)病情況,計(jì)算病情指數(shù)。參照羅來(lái)鑫等的方法對(duì)番茄幼苗的潰瘍病進(jìn)行分級(jí)[8]:0級(jí),不出現(xiàn)葉片(或子葉)萎蔫或莖壞死;1級(jí),葉片(或子葉)輕度變黃或萎蔫;2級(jí),葉片(或子葉)中度萎蔫或莖輕度壞死;3級(jí),葉片(或子葉)嚴(yán)重萎蔫或莖嚴(yán)重壞死;4級(jí),植株死亡。依照下列公式計(jì)算病情指數(shù):

1.2.3 病原菌的分離

分別取各菌株接種發(fā)病的顯癥植株3株,剪取病苗1～2 cm莖段,置于滅菌后的培養(yǎng)皿內(nèi)加1～2滴無(wú)菌水,擠壓出莖部組織液,用接種環(huán)蘸取組織液在ISTA推薦的Cmm半選擇性培養(yǎng)基mSCM平板上畫(huà)線,25～28℃下培養(yǎng)7～14 d,挑取中部具有小黑點(diǎn)的淺黃色單菌落,在YDC培養(yǎng)基平板上純化。

1.2.4 分離物的PCR檢測(cè)

使用Cmm亞種特異性的引物Spf4f/2r對(duì)上述分離物的菌懸液進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,25 μ L反應(yīng)體系中,PCR緩沖液為1×的工作濃度,4種dNTP濃度均為 200 μ mol/L,正向和反向引物濃度均為0.4 μ mol/L,Taq DNA 聚合酶(天根生化公司產(chǎn)品)1.25U。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;隨后94℃變性30 s,60℃退火40 s,72℃延伸40 s,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min,置于4℃保持。將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后在凝膠成像儀(Alpha Innotech公司)觀測(cè)是否得到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源番茄潰瘍病菌致病性測(cè)定結(jié)果

接種21 d后觀測(cè),在46株不同來(lái)源的番茄潰瘍病菌中,大部分菌株表現(xiàn)出致病性(見(jiàn)圖1),其中ZY-0501和01-Cmm病情指數(shù)為0,其余44菌株均表現(xiàn)出不同程度的致病性,具體病情指數(shù)見(jiàn)表2。具有致病性的菌株中,弱致病性菌株9株,占供試菌株的19.6%,中等致病性菌株11株,占供試菌株總數(shù)的23.9%。強(qiáng)致病力菌株24株,占供試菌株總數(shù)的52.2%。

2.2 接種后發(fā)病植株的選擇性培養(yǎng)基分離結(jié)果

通過(guò)使用半選擇性培養(yǎng)基mSCM,從顯癥植株能夠再次分離獲得培養(yǎng)性狀與原接種體一致的菌落,經(jīng)純化后的分離物在YDC培養(yǎng)基上呈黃色黏稠狀菌落(見(jiàn)圖2)。而從無(wú)菌水接種處理的幼苗上未能分離獲得培養(yǎng)性狀與Cmm相似的菌落。

2.3 分離物的PCR鑒定結(jié)果

使用具有亞種特異性的引物Spm4f/2r對(duì)接種后發(fā)病植株的純培養(yǎng)分離物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(菌株ZY-0501和01-Cmm接種后未造成番茄幼苗癥狀,故未獲得再分離培養(yǎng)物),擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)染色和電泳后,可見(jiàn)到特異性的223 bp擴(kuò)增片段(見(jiàn)圖3)。

表2 不同來(lái)源番茄潰瘍病菌致病力差異

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明,利用打頂法可較好地測(cè)定不同來(lái)源番茄潰瘍病菌的致病力差異,根據(jù)病情指數(shù)可將病菌分為強(qiáng)、中、弱等不同的致病類型,而來(lái)自同一地區(qū)不同年份、同一地區(qū)同一年份不同田塊的菌株致病力也可能存在顯著差異。從發(fā)病幼苗分離Cmm時(shí),使用mSCM半選擇性培養(yǎng)基可以避免其他雜菌及腐生菌的污染,從而有效地分離到目標(biāo)菌。

本研究中所選用的番茄品種佳粉10為我國(guó)華北地區(qū)主栽品種。在預(yù)試驗(yàn)中,作者采用3個(gè)品種作為供試的番茄品種,分別為佳粉10、合作908、華南紅寶石,結(jié)果顯示,3個(gè)不同供試品種對(duì)同一菌株的感病性沒(méi)有顯著差異。本研究由于供試菌株數(shù)量較多,以及試驗(yàn)條件的限制,只有部分菌株在2個(gè)番茄品種(佳粉10及華南紅寶石)上進(jìn)行了致病性測(cè)定,結(jié)果同樣表明這兩個(gè)番茄品種對(duì)同一菌株的感病性沒(méi)有顯著差異,表明同一Cmm菌株的致病力在不同番茄品種之間沒(méi)有顯著差異。目前國(guó)外雖然有文獻(xiàn)報(bào)道,在一些與栽培番茄有親緣關(guān)系的野生種中,發(fā)現(xiàn)了一些對(duì)Cmm具有中度抗性的種質(zhì)資源,但世界上尚無(wú)商品化的番茄潰瘍病抗性品種[12-13],這也是番茄抗病育種急需解決的難題之一。

番茄潰瘍病近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外發(fā)生危害比較頻繁,其中在我國(guó)甘肅、河北、內(nèi)蒙古等番茄制種基地和生產(chǎn)田均有不同程度發(fā)生,而不同來(lái)源番茄潰瘍病菌的致病力差異尚未見(jiàn)報(bào)道。調(diào)查不同來(lái)源潰瘍病菌的致病力差異是探索該病菌多態(tài)性以及開(kāi)展其他相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)。本研究供試的番茄潰瘍病菌中,26株菌株采自國(guó)內(nèi)3個(gè)省份6個(gè)不同的地區(qū),其中來(lái)自新疆的菌株XJ-11、XJ-15致病力較強(qiáng),病情指數(shù)均達(dá)到100,因此應(yīng)注意對(duì)該地區(qū)番茄潰瘍病的調(diào)查及預(yù)防,避免發(fā)病田塊種子遠(yuǎn)距離傳播。在20株國(guó)外菌株中,來(lái)自新西蘭的7株大部分沒(méi)有表現(xiàn)出強(qiáng)致病力,可能與這些菌株經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)代培養(yǎng)部分致病力喪失有關(guān),也可能與國(guó)內(nèi)的番茄品種對(duì)這一地區(qū)的Cmm菌株存在一定抗性有關(guān),這些菌株在中國(guó)的適生性還有待進(jìn)一步研究。本研究中不同來(lái)源的Cmm菌株顯現(xiàn)出致病力差異是否是菌株內(nèi)在分子水平的不同導(dǎo)致,還需要通過(guò)rep-PCR、AFLP等手段進(jìn)一步分析,目前該研究正在進(jìn)行中。

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