丁 明，鐘冬蓮

(中國林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400)

油茶 (Camellia oleifera)為山茶科山茶屬多年生木本植物。廣布于亞熱帶地區(qū)，在我國長江流域及以南各省普遍栽培。茶油為油茶籽制得的食用油脂，又名茶籽油或山茶油，色清質(zhì)純，營養(yǎng)豐富，略帶茶油特有的芬芳，是一種高級食用油。茶油具有較強的抗氧化能力，貯藏試驗研究表明，茶油的氧化穩(wěn)定性明顯高于菜籽油、花生油等植物油［1－2］。酚酸在抗氧化性能中起重要作用，同時也是茶油色澤的物質(zhì)之一，酚酸還可能茶油中苦味的來源之一［3］。

目前各種植物的酚酸總量測定方法文獻報道很多，主要采用液液萃取后用 FeCl3法和 Folin-Ciocaltea比色法，但尚未見茶油中總酚測定的報道。采用對傳統(tǒng)的液液萃取的方法和固相萃取提取方法進行比較和驗證，建立了固相萃取Folin-Ciocaltea比色法測定茶油總酚的含量的方法，為進一步研究茶油中酚類物質(zhì)奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集不同等級的浸出和壓榨的茶油4種:江西常山山神精煉高烹油 (J1)和壓榨毛油 (M1)，建德霞霧精煉高烹油 (J2)和壓榨毛油 (M2)。

UVPC-2401(日本島津公司)，Diol－SPE 500 mg/3 mL固相萃取小柱 (美國waters)，0.1 mg分析天平 (梅特勒)，恒溫真空干燥箱 (上海高精)，723型可見分光光度計，150 mL分液漏斗，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，氮吹儀 。咖啡酸 (AR)、碳酸鈉 (AR)、甲醇 (AR)、乙醇 (AR)、甲醇 (色譜醇)、乙腈(AR)、正己烷 (AR)、乙酸乙酯 (AR)。Folinciocaltea試劑:將 50 g Na2WO4·2H2O(AR)、12.5 g Na2MO4·2H2O(AR)、350 mL蒸餾水、85%25 mL H3PO4(AR)、50 mL濃HCl(AR)均置于磨口回流裝置中，用文火回流10 h(回流過程中不使液體沸騰，只維持在緩慢冒氣泡階段)后，再往裝置中加入75 g Li2SO4(AR)、25 mL蒸餾水、數(shù)滴液溴，沸騰15 min，以除去過量的溴，最后冷卻，定容至500 mL，即 Folin-Ciocaltea試劑，使用時加入1倍體積的蒸餾水使酸的濃度為1 mol·L－1。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確稱取咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，用少量甲醇溶解并用蒸餾水定容到100 mL，得1.0 mg·mL－1的對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別量取上述標(biāo)準(zhǔn)液 2.5，5.0，7.5，10.0，15.0，20.0，25.0 mL于7支50 mL容量瓶中，蒸餾水定容，制備成濃度0.05～0.5 mg·mL－1的咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取各濃度標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL于7支50 mL容量瓶中，另取1支做空白，各加25 mL蒸餾水，搖勻，再分別加0.5 mL Folin-Ciocaltea試劑，充分搖勻。3 min后，加入10% 碳酸鈉溶液(10 g碳酸鈉溶入100 g水)1.0 mL，混勻定容。在35℃下反應(yīng)120 min，于 725 nm波長下比色，測定吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣品處理

液液萃取。取一定量毛油，用溶劑等體積萃取3次，合并萃取液，在40℃ 真空濃縮至近干，用相應(yīng)溶劑5 mL分多次洗出于10 mL離心管 中，10 000 r·min－1下離心10 min，冷凍脫脂后吸取上層醇相于5 mL刻度管中，相應(yīng)溶劑定容，得到總酚提取物溶液。用Folin-Ciocalteau法定量。

固相萃取。取一定量毛油，用適量正己烷溶解，固相萃取小柱用適量正己烷活化，上樣，上樣后再用適量正己烷溶解油樣，并用適量正己烷∶乙酸乙酯(9∶1)洗脫酯溶性物質(zhì)，然后用10 mL溶劑洗脫酚酸并收集，40℃下氮氣吹干，再用1 mL相應(yīng)溶劑洗出于1 mL離心管中，10 000 r·min－1下離心10 min，冷凍脫酯，得到總酚提取物溶液。用Folin-Ciocalteau法定量。

1.2.4 反應(yīng)體系

取一定體積待測溶液用蒸餾水定容至25 mL，再依次加入 0.5 mL Folin-Ciocaltea試劑 (靜置 3 min)，10%碳酸鈉溶液1 mL，蒸餾水定容到50 mL，35℃下反應(yīng)120 min，于725 nm波長下測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

建立吸光度 (D)與咖啡酸濃度 (X)標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.05～0.5 mg·mL－1濃度范圍內(nèi)，線性回歸方程為D=1.097 9X－0.014 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 9。

2.2 固相萃取小柱及洗脫溶劑

分別試驗C18、硅膠、弗羅里硅土以及二醇基等固相萃取小柱，發(fā)現(xiàn)Diol-SPE 500 mg/3 mL固相萃取小柱 (美國waters)效果明顯較好，這可能與酚類物質(zhì)極性較大，在二醇基等固相萃取小柱具有良好的保留作用相關(guān)。

分別采用100%甲醇，80%甲醇，80%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，100%乙腈，100%乙醇作為洗脫溶劑按固相萃取后測定。由表1可見90%的乙醇洗脫效果最好，測得的總酚含量最高。這可能與茶油總除了極性較大的酸性酚類物質(zhì)外還有較多的中性酚類物質(zhì)，因此90%的乙醇洗脫比較完全而且乙醇價格便宜、對人體毒害小，是一種較好的提取溶劑。

表1 茶油不同溶液萃取總酚的效果

2.3 液液萃取與固相萃取方法比較

在樣品中添加0.02，0.04，0.06 mg單個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)，分別用液液萃取和固相萃取方法測吸光度，得出總酚的含量，以加標(biāo)測得的量減去原樣的量，除以加標(biāo)量，計算回收率。由表2可知，固相萃取的添加平均回收率達99.36% ～110.02%，明顯高于液液萃取的72.03% ～81.33%，酚類物質(zhì)是一類帶有非極性基團的極性化合物，因此，液液萃取不能完全萃取以及液液萃取由于萃取歷時較長加上濃縮時加熱等過程使較多的酚類物質(zhì)被氧化而導(dǎo)致回收率明顯下降。在固相萃取中隨著標(biāo)準(zhǔn)的添加量的增加，回收率有較大幅度的下降，這與固相萃取小柱柱容量有關(guān)，當(dāng)添加過多的標(biāo)準(zhǔn)使小柱過載從而導(dǎo)致回收率下降。

表2 加標(biāo)回收試驗結(jié)果(n=5)

2.4 穩(wěn)定性實驗

取1油樣按上述樣品溶液制備及測定方法，于4℃放置 0，2，4，6，8，15，21 h測定吸光度值。從表3可以看出，由于酚類物質(zhì)被氧化，其總量值略有下降的趨勢，但6 h內(nèi)溶液穩(wěn)定性良好，隨著時間的延長，有較大幅度的下降，RSD為3.98%。

2.5 精密度

取茶油樣品按固相萃取方法提取及測定方法，重復(fù)測定 5次，結(jié)果如表 4所示，得RSD為0.36%(n=5)。

表3 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.6 重現(xiàn)性

稱取相同質(zhì)量的茶油5份，按固相萃取方法及測定方法，測定吸光度值，結(jié)果如表5所示，得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.53%，表明具有良好的重現(xiàn)性。

表4 精密度實驗結(jié)果

表5 重現(xiàn)性實驗結(jié)果

2.7 實際樣品的測定

按固相萃取方法測定不同廠家的浸出油和壓榨油中總酚，結(jié)果如表6所示。由表6可見，經(jīng)過精煉的茶油總酚含量明顯低于毛油，不同廠家的趨勢也相同，可見茶油在經(jīng)過脫酸、脫臭等處理后，將大部分的酚類物質(zhì)去除，其抗氧化能力大大減弱;而毛油因只經(jīng)壓榨處理，保留大部分的酚類物質(zhì)。

表6 不同茶油樣品中的總酚含量

3 小結(jié)

通過液液萃取與固相萃取的比較可見，采用正己烷溶解，經(jīng)二醇基固相萃取小柱分離富集后，90%乙醇洗脫并收集，40℃下氮氣吹干，再用1 mL相應(yīng)溶劑洗出于離心管中，10 000 r·min－1下離心10 min，冷凍脫酯，用Folin-Ciocalteau法測定茶油中的總酚含量，回收率高、靈敏度高，精密度、準(zhǔn)確度好，而且操作簡單、快速又節(jié)約成本，實為較好測定茶油中總酚的方法。

［1］叢林美，姚小華，費學(xué)謙.長期儲藏對茶油酸值和過氧化值的影響 ［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2007，20(2):246－250.

［2］程建華，楊衛(wèi)民，張鳳枰，等.油樣短期存放條件對過氧化值測定的影響 ［J］.中國油脂，2004，29(2):55－58.

［3］Mailer R. Chemistry and quality of olive oil［J］.Profitable＆sustainable Pimary Industies， 2006 (8):227－230.