丁征平 張杰 邵晉晨

肺癌是目前人類癌癥死亡的最主要原因之一。全世界每年有500萬人死于肺癌。近20年來，中國肺癌的發(fā)生率也在明顯上升。肺癌中約80%為非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）。早期NSCLC患者完全手術切除后，5年生存率大約為30%-70%，存在很大的異質性，這引起了人們的思考。肺癌的臨床期別仍是最重要的臨床預后指標之一，同時也是極為重要的治療預測因子，但對于每一個體而言，這種預后標記并不嚴密。當前很多研究著重于尋找與疾病復發(fā)相關的分子標記，以便篩查出潛在獲益的人群進行更加個體化的治療。此外，要進一步提高完全切除術后的中早期NSCLC患者的長期生存率，尚需要尋找新的可能的靶點并發(fā)展新的治療手段。

對NSCLC生物學特性更多的了解，有助于預測腫瘤的復發(fā)以及選擇對復發(fā)、生存率和生活質量效果最佳的治療性干預措施。核苷酸切除修復途徑中的蛋白質可以修復鉑類藥物引起的DNA損傷。核苷酸切除修復交叉互補 （excision repair cross-complementing, ERCC）基因家族通過核苷酸進行切除和修復以減少DNA的損傷。其過程首先是將修飾過的核苷酸連同毗鄰的核苷酸一起從損傷的核苷酸鏈移除，隨后在DNA聚合酶的作用下合成完好如初的核苷酸鏈[1]。ERCC1基因編碼一種含有297個氨基酸的蛋白質，這種蛋白質通過與XPF和ERCC4共同組成一復合體而發(fā)揮作用[2]。該復合體可能是重組性修復和核苷酸切除修復過程所必需的[3,4]。核切除修復功能受損可增加基因組的不穩(wěn)定性，進而導致腫瘤發(fā)生更多的惡性表型行為。癌癥基因的不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)為癌癥患者的染色體結構畸變（即缺失、轉位和插入）。當DNA雙鏈斷口通過同源性重組和非同源性末端連接方式進行損傷性修復時即可出現(xiàn)上述染色體結構畸變現(xiàn)象。本研究采用免疫組化方法檢測ERCC1在腫瘤中的表達，以評估ERCC1表達對118例接受過根治性切除的I期NSCLC患者生存率的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床與病理資料 對118例2007年1月-2009年1月期間就診于上海市胸科醫(yī)院肺部腫瘤臨床醫(yī)學中心手術的I期NSCLC患者進行回顧分析，排除病理類型不詳的患者（表1）。術前分期工作包括：血液生化檢查、胸部CT掃描、上腹部B超和CT、骨同位素掃描、纖維支氣管鏡檢查、頭顱CT或MRI檢查。疑似有遠處轉移的患者均被排除。所有患者均接受完整手術切除，支氣管切斷均為陰性。

表 1 患者的一般特征Tab 1 Patient Characteristics

1.2 免疫組化 免疫組化染色采用Envision法。挑選相應存檔蠟塊，連續(xù)石蠟切片厚4 μm。按EnVision法進行免疫組織化學法檢測。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，pH6.0檸檬酸加熱抗原修復；3%H2O2阻斷過氧化物酶；加入一抗50 μL/片，4oC過夜，ERCC1鼠抗1:80TBS稀釋（ERCC1購自Abcom公司）；加入二抗50 μL/片，室溫60 min；DAB顯色5 min-10 min。各步驟間均用TBS緩沖液沖洗5 min×3次，蘇木素襯染，烤干、封片。ERCC1陽性定位于細胞核；陽性細胞＜10%記為“-”，陽性細胞＞10%記為“+”。以已知陽性切片作為陽性對照，以TBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學分析 數據以SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，用Kaplan-Meier進行生存分析，Log-rank檢驗分析生存差異，建立Cox回歸分析了解患者的預后相關因素?？ǚ綑z驗、Fisher's確切概率法進行顯著性檢驗，Spearman等級相關進行相關性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果 如圖1所示。

2.2 臨床隨訪 最終隨訪日期為2010年3月20日，中位隨訪時間為34.14個月，118例患者的中位年齡為65歲，未有患者接受術后化療。生存期定義為患者手術之日至由于任何原因死亡或是末次隨訪時間。

2.3 總體生存期（overall survival, OS） ERCC1陽性的患者（n=80）3年生存率優(yōu)于ERCC1陰性的患者（n=38）（86.12% vs 65.46%; P=0.025）（圖2）。Cox多因素分析提示年齡、性別、吸煙史、ERCC1表達情況是影響患者預后的因素（表2）。

3 討論

本研究中評價了腫瘤內ERCC1表達對NSCLC患者經手術切除后生存期的影響。ERCC1屬于核切除修復基因家族，它編碼一種蛋白質，這種蛋白質能與修復復合體的其他它成員協(xié)同通過修復核苷酸的化學變化和結構改變以確保基因組的完整性。我們發(fā)現(xiàn)，對于經手術切除的NSCLC患者來說，ERCC1表達的增加是生存率改善的一個顯著且獨立的預測指標。我們認為，正是腫瘤內的ERCC1參與了腫瘤DNA的修復，從而影響了腫瘤的生物學行為。

圖 1 ERCC1免疫組化結果。A：ERCC1陽性患者的染色（×400）；B：ERCC1陽性患者的染色（×100）。Fig 1 Immunohistochemical results of ERCC1. A: ERCC1 positive expression in NSCLC tissue (×400); B: ERCC1 positive expression in NSCLC tissue (×100).

圖 2 不同ERCC1水平的患者生存情況Fig 2 Patients survival according to ERCC1 status

表2 影響患者生存狀況的多因素分析Tab 2 Multivariate analysis of prognostic factors

關于ERCC1表達影響腫瘤生物學行為的機制，我們歸之為ERCC1修復細胞內DNA損傷的能力。當前關于腫瘤發(fā)生和發(fā)展的學說是假定基因損傷不斷地在上皮細胞內累積。已發(fā)表的文獻報道[5,6]也表明，伴有DNA倍體異常、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和等位基因缺失的多種基因組變化使肺癌更多出現(xiàn)生長速度加快和遠處轉移等惡性表現(xiàn)。肺癌的基因組改變紛繁復雜，從數量極少但生物學意義極為重要的基因畸變到廣泛的基因組損傷皆可發(fā)生。該損傷的程度可能取決于接觸致癌物的類型和劑量以及細胞自身修復該損傷的能力。與那些損傷較小的細胞相比，發(fā)生廣泛損傷的細胞，逃避了機體正常的趨凋亡監(jiān)控機制，具有增殖優(yōu)勢和更多惡性表型行為。本研究中所測定的DNA損傷修復基因ERCC1，可能對細胞自身的DNA損傷修復能力具有代表性，因而也是腫瘤內累積的DNA損傷程度的間接性生物標記物。

然而，ERCC1表達的增加也預示著對順鉑抗藥性的增加，這是與ERCC1在損傷核苷酸修復中的作用相吻合的，尤其是ERCC1能使順鉑誘導的DNA絡合物的清除增加[7,8]。因此，對于那些接受過以順鉑為基礎的化療的進展期癌癥患者，ERCC1表達增加的結果是促進鉑類誘導的DNA絡合物的清除，從而降低了療效和生存率。

臨床研究表明，含鉑方案輔助化療可使完全切除的非小細胞肺癌患者生存受益。完全切除術后的非小細胞肺癌術后含鉑方案輔助化療可改善5年生存，延長5年生存率4%-15%。但是臨床研究[9,10]也顯示，術后含鉑方案輔助化療有較多的不良反應，不同患者對治療的耐受性也有很大差別，且術后輔助化療的結果有很強的異質性，不同分期和腫瘤負荷的患者術后輔助化療結果有很大的差別，只有部分患者可從中獲益。

總之，ERCC1在肺癌的發(fā)生發(fā)展及臨床治療方面的作用正逐漸清晰，ERCC1表達的水平對于生存狀況具有預測意義。這可能是由于其對DNA損傷卓有成效的修復作用減少了基因組損傷累積的結果。但是，ERCC1水平的增加同時也降低了以鉑類為基礎的化療方案的益處，一旦被證實，那么將來關于輔助治療和新輔助化療的試驗設計均需考慮到上述結論。由于低ERCC1表達患者生存率相對較低，但腫瘤對鉑類為基礎的化療方案相對敏感，因此這部分患者將可能從鉑類為基礎的化療方案中獲得最大收益。