伍小燕，李茂（1.廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，南寧市 53003；.廣西中醫(yī)藥研究院，南寧市 5300）

益智康腦丸對老年性癡呆大鼠行為學(xué)及腦組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

伍小燕1＊，李茂2（1.廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，南寧市 530023；2.廣西中醫(yī)藥研究院，南寧市 530022）

目的：探討益智康腦丸對老年性癡呆（AD）大鼠行為學(xué)及腦組織凋亡蛋白的影響。方法：復(fù)制D-半乳糖AD大鼠模型。實(shí)驗(yàn)分為4組，即空白、模型、益智康腦丸和腦復(fù)康組，檢測大鼠行為學(xué)及腦組織抑制細(xì)胞凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax表達(dá)指標(biāo)的改變。結(jié)果：模型組與空白組比較，學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，Bcl-2/Bax比值下降；治療組與模型組比較，學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善，Bcl-2/Bax比值增加。結(jié)論：益智康腦丸具有較好的治療AD作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)AD大鼠腦組織Bcl-2的表達(dá)、降低Bax的表達(dá)有關(guān)。

老年性癡呆；益智康腦丸；行為學(xué)；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白

老年性癡呆又稱阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD），是指老年老化程度超過生理性老化，或過早老化，致使腦功能障礙，引起獲得性、持續(xù)性智能障礙，是以進(jìn)行性癡呆為主要表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。其首要癥狀是智力、記憶力、感官定向能力、判斷力、語言思維能力不可逆的進(jìn)行性退化，并常伴有性格改變。益智康腦丸用于治療脾腎兩虧、腦髓空虛所致之老年性癡呆病，臨床應(yīng)用多年，療效顯著。本研究旨在通過復(fù)制老年性癡呆大鼠模型，探討該方對模型大鼠行為學(xué)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，以進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

腦立體定位儀（淮北正華公司）；被動(dòng)回避反應(yīng)箱（上海騏馳儀器有限公司）；CX31型顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試藥

益智康腦丸（廣西強(qiáng)壽藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：060901，每丸重3 g，由0.9%生理鹽水配制為所需濃度）；腦復(fù)康（天津金世制藥有限公司，批號：060318）；促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因Bax、抑制細(xì)胞凋亡基因Bcl-2免疫組化試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 動(dòng)物

健康Wistar大鼠40只，6～7周齡，♀♂兼用，體質(zhì)量180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2003-0003）。

2 方法

2.1 模型的復(fù)制

[1]，采取D-半乳糖+喹啉酸（QA）法復(fù)制老年性癡呆大鼠模型。除空白組每日ip 0.5 mL生理鹽水外，其余各組每日ip 0.5 mL D-半乳糖（500 mg·kg-1），連續(xù)7周，復(fù)制大鼠衰老模型。7周后除空白組外，各組大鼠均用1%的戊巴比妥鈉麻醉，固定在腦立體定位儀上，暴露前囟，按腦立體定位圖譜鉆開顱骨，緩慢將微量注射器垂直進(jìn)入到注射部位，注射lμL 75 nmol·μL-1的QA。注射完畢后，留針10 min，然后緩慢拔針，用牙科泥封堵顱骨上的鉆空。術(shù)后1周各組進(jìn)行行為學(xué)測試。

2.2 分組及給藥

將40只大鼠隨機(jī)分為空白（等量生理鹽水）、模型（等量生理鹽水）、腦復(fù)康（0.7 g·kg-1）和益智康腦丸（4.5 g·kg-1）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)給藥3周。術(shù)后進(jìn)行1周行為學(xué)測試后給藥，連續(xù)ig 3周后再進(jìn)行行為學(xué)測試。

2.3 行為學(xué)測試

采用跳臺法。跳臺裝置為一個(gè)25 cm×20 cm×75 cm的被動(dòng)回避反應(yīng)箱，箱底鋪直徑為1 mm的銅柵，通36 V交流電，銅柵的一角固定一個(gè)8 cm×8 cm×5 cm大小的塑料泡沫塊作為動(dòng)物回避電擊反應(yīng)的安全區(qū)。先將大鼠放入箱中自由活動(dòng)5 min熟悉環(huán)境，然后接通銅柵電源，大鼠受到電擊后跳回安全區(qū)以躲避傷害性刺激，然后大鼠再次跳至銅柵上，受到電擊（雙足同時(shí)接觸銅柵）又跳回安全區(qū)，如此反復(fù)5 min，記錄每只大鼠首次找到安全區(qū)至第一次跳下安全區(qū)的時(shí)間（潛伏期）和5 min內(nèi)受到的電擊次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)），作為測試結(jié)果。第1天為學(xué)習(xí)訓(xùn)練期，其后連續(xù)7 d測試，記錄各組大鼠5 min內(nèi)觸電潛伏時(shí)間及錯(cuò)誤次數(shù)，計(jì)算其平均值。

2.4 腦組織Bcl-2、Bax含量的測定[2]

在行為學(xué)測試結(jié)束后，進(jìn)行腦組織取材。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定頭及四肢，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈，同時(shí)剪開右心耳，依次用Ringer液、4%多聚甲醛的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液200 mL灌注固定大鼠，注畢取腦，固定于苦味酸中12～24 h，石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟至水，進(jìn)行免疫組化染色。用蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min后進(jìn)行微波抗原修復(fù)，用3%H2O2去離子水孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加正常血清封閉液，室溫孵育10～15 min，傾去，勿洗。每張切片加入1∶200倍稀釋Bax、Bcl-2抗體，37℃孵育2 h，PBS沖洗后加入生物素化二抗工作液，37℃孵育10～15 min，PBS沖洗后加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，室溫孵育10～15 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片，顯微鏡觀察。鏡下觀察，細(xì)胞核與細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，每組取8個(gè)切片，每個(gè)切片隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，取平均值進(jìn)行比較。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s 表示，組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料率的比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)測試結(jié)果

用藥前，與空白組比較，各組大鼠跳臺潛伏期均縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加（P＜0.05）；用藥后，與模型組比較，益智康腦丸組與腦復(fù)康組大鼠跳臺潛伏期均顯著延長，觸電錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少（P＜0.05），但兩藥物組之間比較無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，益智康腦丸可以改善模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。各組大鼠跳臺潛伏期比較見表1；各組大鼠跳臺錯(cuò)誤次數(shù)比較見表2。

表1 各組大鼠跳臺潛伏期比較（±s）Tab 1 Comparison of latency in the step down tes（t±s）

表1 各組大鼠跳臺潛伏期比較（±s）Tab 1 Comparison of latency in the step down tes（t±s）

與空白組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

劑量/g·kg-1n組別空白組模型組益智康腦丸組腦復(fù)康組- -用藥后潛伏期/s 250.15±51.20 173.08±32.17＊216.68±43.37#220.14±30.75#4.5 0.7 10 10 10 10用藥前潛伏期/s 241.25±40.36 176.02±36.25＊180.14±40.81＊178.30±45.04＊

表2 各組大鼠跳臺錯(cuò)誤次數(shù)比較（±s）Tab 2 Comparison of incorrect times in the step down test（±s）

表2 各組大鼠跳臺錯(cuò)誤次數(shù)比較（±s）Tab 2 Comparison of incorrect times in the step down test（±s）

與空白組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

治療后錯(cuò)誤次數(shù)4.3±1.4 9.9±1.8＊5.1±2.9#5.5±3.4#劑量/g·kg-1n組別空白組模型組益智康腦丸組腦復(fù)康組- -4.5 0.7 10 10 10 10治療前錯(cuò)誤次數(shù)4.5±1.8 10.1±2.6＊7.9±1.6＊8.2±2.1＊

3.2 腦組織Bcl-2和Bax免疫組化結(jié)果

與空白組比較，模型組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.01）；與模型組比較，益智康腦丸組與腦復(fù)康組Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.01），兩藥物組之間比較無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，益智康腦丸能顯著抑制Bax蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。各組大鼠腦組織Bcl-2和Bax表達(dá)的比較見表3。

表3 各組大鼠腦組織Bcl-2和Bax表達(dá)的比較（±s）Tab 3 Comparison of the expression of Bcl-2 and Bax in cerebral tissue of rats（±s）

表3 各組大鼠腦組織Bcl-2和Bax表達(dá)的比較（±s）Tab 3 Comparison of the expression of Bcl-2 and Bax in cerebral tissue of rats（±s）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

組別空白組模型組益智康腦丸組腦復(fù)康組劑量/g·kg-1n- -Bcl-2/Bax 0.94 0.52 1.97 1.72 4.5 0.7 10 10 10 10 Bax 2.04±0.18 15.29±2.65＊8.26±2.04#8.51±3.06#Bcl-2 1.92±0.68 7.91±1.36＊16.31±3.19#14.62±2.94#

4 討論

近年來研究表明，細(xì)胞凋亡參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變，與衰老和老年性癡呆的發(fā)生存在著密切聯(lián)系。老年性癡呆神經(jīng)元凋亡的具體機(jī)制可能與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)失調(diào)等因素有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)與凋亡有關(guān)的基因分為2類：誘導(dǎo)凋亡基因和抑制凋亡基因。在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中，Bcl-2家族是不可缺少的，Bcl-2是重要的抗凋亡基因，在細(xì)胞色素C的釋放調(diào)控中起重要作用[2]。Bcl-2與Bax是一對相互拮抗的蛋白質(zhì)，它們形成二聚體，拮抗對方的功能，Bcl-2具有明顯抑制凋亡作用，而Bax則促進(jìn)凋亡。Bax和Bcl-2形成復(fù)合體而失去作用。由此可見，損傷刺激后，Bax和Bcl-2表達(dá)的比率在很大程度上影響凋亡的產(chǎn)生[3]。

益智康腦丸是立足于壯醫(yī)理論而成方，以壯族民間藥物五指毛桃根、扶芳藤為主藥，配合牛大力、千斤拔、紅參、熟地、肉蓯蓉、山藥等諸藥合用，共奏補(bǔ)脾腎、益精血、健腦髓、養(yǎng)“巧塢”之功，臨床用于治療腦髓空虛、“巧塢”失養(yǎng)之老年性癡呆、腦萎縮癥療效顯著[4]。本研究結(jié)果表明，造模后，在機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制下，Bcl-2蛋白表達(dá)反應(yīng)性增強(qiáng)，同時(shí)啟動(dòng)了凋亡程序，使Bax表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。藥物干預(yù)后，Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，Bax表達(dá)減弱，抑制細(xì)胞凋亡。表明益智康腦丸對老年性癡呆的改善作用可能是通過上調(diào)Bcl-2蛋白、下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)，從而改善老年性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

參考文獻(xiàn)

[1]齊曦明，韓玉生，周忠光，等.癡呆靈膠囊對老年癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶影響及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2004，32（1）：45.

[2]Wnag HQ，Nakaya Y，Du ZY，et al.Interaction of presenilins with FKBP38 promotes apoptosis by reducing mitochondiral Bcl-2[J].Hum Mol Genet，2005，14（13）：1 889.

[3]Yao MZ，Nguyen TV，Pike C，et al.B-Amyloid-induced neuronal apoptosis involves c-jun N-terminal kinase-dependent downergulation of Bcl-w[J].Journal Neurosci，2005，25（5）：1 149.

[4]黃漢儒.中國壯醫(yī)學(xué)[M].南寧：廣西民族出版社，2000：12.

Effect of Yizhi Kangnao Pills on Ethology and the Expression of Bcl-2 and Bax in Cerebral Tissue of AD Rats

WU Xiao-yan（The First Affiliated Hospital of Guangxi College of TCM，Nanning 530023，China）
LI Mao（Guangxi Institute of TCM，Nanning 530022，China）

OBJECTIVE：To explore the effect of Yizhi kangnao pills on ethology and the expression of Bcl-2 and Bax in cerebral tissue of AD rats.METHODS：The D-galactose AD rat model was established.Rats were divided into blank group，model group，Yizhi kangnao pill group and Piracetam control group.The change of ethology and the expression of Bcl-2 and Bax in cerebral tissue were detected.RESULTS：Compared with blank group，the ability of learning and memory of rats in model group decreased significantly and the ratio of Bcl-2/Bax in the hippocampus came down.Compared with model group，the ability of learning and memory of rats in Yizhi kangnao pills group was improved significantly and the ratio of Bcl-2/Bax rose.CONCLUSION：The results show that Yizhi kangnao pills have good therapeutic effect on AD.The mechanism is associated with the improvement of the expression of Bcl-2 and reduction of the expression of Bax in cerebral tissue of AD rats.

AD；Yizhi kangnao pills；Ethology；Bcl-2；Bax

R285；R97

A

1001-0408（2010）39-3673-03

2010-06-11

2010-08-23）