張梅英,吳紅聯(lián),楊葳,李兆陽(yáng),董婉維,周生來(lái),于洋,王惟,呂相川,秦英,鄭志紅,王祿增

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部,沈陽(yáng) 110001)

5-脂氧化酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備

張梅英,吳紅聯(lián),楊葳,李兆陽(yáng),董婉維,周生來(lái),于洋,王惟,呂相川,秦英,鄭志紅,王祿增

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部,沈陽(yáng) 110001)

目的 建立5-脂氧化酶(5-LO)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病分子機(jī)制的研究。方法通過(guò)顯微注射的方法,將5-脂氧化酶基因片段(6.8 kb)導(dǎo)入BDF1受精卵雄原核并移植到同期受孕的假孕母鼠輸卵管中,對(duì)產(chǎn)出仔鼠的鼠尾組織DNA進(jìn)行PCR、Southern b lot檢測(cè),對(duì)9、20、24號(hào)轉(zhuǎn)基因小鼠分別提取腹腔細(xì)胞、骨髓細(xì)胞及脾、腎組織總RNA和蛋白,并采用RT-PCR、W estern b lot方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)和蛋白表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果共產(chǎn)生25只子代小鼠,經(jīng)PCR和Southern檢測(cè)獲得7只陽(yáng)性小鼠,經(jīng)RT-PCR和W estern b lot檢測(cè)結(jié)果表明,9、20、24號(hào)轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、脾、腎5-LO和5-脂氧化酶激活蛋白(FLAP)在RNA和蛋白水平表達(dá)均高于正常BDF1對(duì)照小鼠,且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析腹腔細(xì)胞、骨髓細(xì)胞表達(dá)均具有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論成功建立5-LO轉(zhuǎn)基因小鼠模型。

5-脂氧化酶;動(dòng)脈粥樣硬化;轉(zhuǎn)基因

動(dòng)脈粥樣硬化癥(atherosc lerosis,AS)是危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)重要疾病,目前AS已被公認(rèn)亦是一慢性炎癥性疾病[1-4],自2002年來(lái),日益增多的證據(jù)表明5-脂氧化酶(5-lipoxygenase,5-LO)及其衍生物白三烯族(leukotrienes,LTs)炎性介質(zhì)參與了AS發(fā)生的炎癥反應(yīng)形成過(guò)程[5-7]。但是,5-LO過(guò)表達(dá)導(dǎo)致AS發(fā)生的炎癥反應(yīng)機(jī)制目前并不完全清楚,為此,我們擬建立高表達(dá)5-LO的轉(zhuǎn)基因小鼠,通過(guò)該模型進(jìn)一步闡明5-LO過(guò)表達(dá)與AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BDF1小鼠(C57BL/6×DBA/2)、ICR小鼠為SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物【SCXK(京)2002-0003】,均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。飼料購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司【SCXK(京)2005-0007】。飲用水為高壓酸化水(pH 2.5～3)),動(dòng)物飼養(yǎng)于12h明暗循環(huán)的屏障系統(tǒng)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)實(shí)驗(yàn)用鼠均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 菌種與質(zhì)粒

感受態(tài)DH5α大腸桿菌(E.co li)由本室保存; pEGFP-5LO質(zhì)粒由美國(guó)哈佛大學(xué)金壯教授惠贈(zèng)。

1.3 試劑與設(shè)備

M 2、M 16培養(yǎng)液、透明脂酸酶、礦物油購(gòu)自Sigm a公司,限制性?xún)?nèi)切酶、PCR片段純化試劑盒、DNA小量提取試劑盒為大連寶生物工程公司產(chǎn)品, Q IAquick gel extraction kit為Q iagen公司產(chǎn)品,PCR引物、Trizo l RNA試劑盒為Invitrogen產(chǎn)品,5-LO和5-脂氧化酶激活蛋白(FLAP)抗體為Chem icon公司產(chǎn)品。孕馬血清(PM SG)為寧波市激素制品廠生產(chǎn),人絨毛膜促性腺激素(hCG)為上海生物化學(xué)制藥廠生產(chǎn),其他試劑為國(guó)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)純級(jí)。

倒置相差顯微鏡和顯微操作系統(tǒng)為O lympus I X71型、注射泵為Eppendorf公司產(chǎn)品,拉針儀和煅燒議為Narishige公司出品,G-1硝子管和GD-1硝子管購(gòu)于尼康公司,其他儀器包括解剖顯微鏡、二氧化碳培養(yǎng)箱和常規(guī)手術(shù)器械。

1.4 顯微注射目的片段的純化

用Stu I對(duì)pEGFP-5LO質(zhì)粒進(jìn)行單酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段,用Q IAquick gel extraction kit試劑盒純化回收約6.8 kp片段。純化后DNA以約3 ng/μL的濃度溶解于m icroinjection buffer(5 mmo l Tris pH 7.4,0.1 mmo l EDTA)中, -20℃保存?zhèn)溆?用于顯微注射。

1.5 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

將上述純化的5-脂氧化酶與GPF融合蛋白基因片段用顯微注射法注入BDF1小鼠受精卵雄原核中,將注射后存活的受精卵移植到I CR假孕母鼠雙側(cè)輸卵管,待產(chǎn)。

1.6 轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測(cè)

1.6.1 鼠尾組織基因組DNA的抽提:剪取出生15 d后的小鼠尾組織0.5～1 cm,55℃蛋白酶K消化過(guò)夜,常規(guī)酚/氯仿法抽提DNA,4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 轉(zhuǎn)基因小鼠PCR檢測(cè):根據(jù)pEGFP-5LO質(zhì)粒中GFP與5-LO基因序列設(shè)計(jì)并合成引物,預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為900 bp;引物序列為:p1:5′-TCCAGGAGCGCACCATCTTC-3′;p2:5′-TGCCGT GTTTCCAGTTCTTTAC-3′,PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性溫度:95℃5 m in,變性溫度:94℃50 s,退火溫度:55℃50 s,延伸溫度:72℃50 s,33循環(huán),72℃10 m in。用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的分析。PCR反應(yīng)體系為50μL,取1μL基因組DNA為模板。

1.6.3 轉(zhuǎn)基因小鼠Southern blot檢測(cè):PCR檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠及陰性對(duì)照BDF1小鼠基因組DNA (約30μg)Eco R I 37℃水浴過(guò)夜酶切,1%瓊脂塘凝膠100 V電泳2 h,凝膠處理后采用毛吸印跡法尼龍膜{帶正電}轉(zhuǎn)移DNA,GFP與5-脂氧化酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為探針并采用DNA凝膠回收試劑盒純化探針,α-32P同位素標(biāo)記探針。

1.6.4 轉(zhuǎn)基因小鼠RNA水平表達(dá)檢測(cè):分別選取9、20、24號(hào)F0代轉(zhuǎn)基因小鼠,采用Trizo l RNA試劑盒提取腹腔細(xì)胞、骨髓細(xì)胞及脾臟、腎組織中的總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行5-LO和FLAP檢測(cè)。

1.6.5 轉(zhuǎn)基因小鼠蛋白水平表達(dá)檢測(cè):分別選取9、20、24號(hào)F0代轉(zhuǎn)基因小鼠,提取總蛋白,采用W estern b lo t方法對(duì)腹腔細(xì)胞、骨髓細(xì)胞及脾臟、腎組織進(jìn)行5-LO和FLAP表達(dá)檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示,均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

顯微注射166枚受精卵,并將90枚注射過(guò)的受精卵移植于3只I CR受體小鼠的輸卵管中,共產(chǎn)仔25只。

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測(cè)結(jié)果

用所設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)出生仔鼠進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè),25只仔鼠中有7只小鼠能擴(kuò)增出約900 bp大小的特異片段,其中5、8、9、11、14、15號(hào)泳道為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠,見(jiàn)圖1。

2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠的Sou thern b lot檢測(cè)結(jié)果

圖1 部分F0代的轉(zhuǎn)基因小鼠PCR檢測(cè)電泳結(jié)果No te:M.DNA m arker DL2000;1.Control;2. Positive con tro l:pEGFP-5LO p lasm id;4.Negative contro l,nor m almouse;5-18:Transgenic founderm iceF ig.1 Electrophoretic resu ltsof PCR p roducts from transgenic m ice of founders

用Eco R I酶切PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的F0代轉(zhuǎn)基因小鼠和正常BDF1小鼠(陰性對(duì)照)基因組DNA,并以GFP-5LO基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為探針,結(jié)果見(jiàn)圖2, 1、9、13、17、20、22、24號(hào)PCR檢測(cè)陽(yáng)性小鼠基因組DNA可見(jiàn)特異整合條帶,正常小鼠基因組DNA未見(jiàn)特異條帶,證實(shí)PCR陽(yáng)性小鼠基因組DNA中已穩(wěn)定整合5-LO基因。

圖2 轉(zhuǎn)基因小鼠Southern b lot檢測(cè)結(jié)果Note:The p robes:Positive contro l is PCR p roduct of hyg gene;Num ber 1,9,13,17,2,22,24 are positive transgenic m ice detected by PCR;N:Norm almouseF ig.2.Resultsof Southern b lo t of transgenic m ice

2.4 轉(zhuǎn)基因小鼠的RNA水平檢測(cè)結(jié)果

RT-PCR方法對(duì)9、20、24號(hào)5-LO轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的骨髓細(xì)胞、腹腔細(xì)胞、脾、腎組織內(nèi)5-LO及FLAP進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)以正常BDF小鼠為陰性對(duì)照, β-actin為PCR體系內(nèi)對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、脾、腎的5-LO及FLAP mRNA檢測(cè)結(jié)果F ig.3.Resultsof 5-LO and FLAP mRNA detected by RT-PCR of peritoneal cells,bone m arrow cells,sp leen and k idney of transgenic m ice

由圖3可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細(xì)胞、腹腔細(xì)胞、脾、腎的5-LO和FLAP mRNA表達(dá)均高于正常小鼠,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明5-LO轉(zhuǎn)基因小鼠與陰性對(duì)照小鼠的骨髓、腹腔細(xì)胞的5-LO及FLAP比較均有顯著差異,轉(zhuǎn)基因小鼠間差異無(wú)顯著性。

2.5 轉(zhuǎn)基因小鼠的蛋白水平檢測(cè)結(jié)果

W estern blot方法對(duì)9、20、24號(hào)5-LO轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的骨髓、腹腔細(xì)胞、脾、腎組織進(jìn)行5-LO及 FLAP檢測(cè),同時(shí)以正常BDF1小鼠為陰性對(duì)照,βactin為體系內(nèi)對(duì)照,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細(xì)胞、腹腔細(xì)胞、脾、腎的5-LO和FLAP蛋白表達(dá)均明顯高于正常小鼠,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明5-LO轉(zhuǎn)基因與陰性對(duì)照小鼠的骨髓、腹腔細(xì)胞、脾、腎的5-LO及FLAP比較均有極顯著差異,而轉(zhuǎn)基因小鼠間差異無(wú)顯著性。

圖4 轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、脾、腎的5-LO及FLAP蛋白檢測(cè)結(jié)果F ig.4.Resultsof 5-LO and FLAP p roteins detected byW estern b lo tof peritoneal cells,bonem arrow cells,sp leen and kidney of transgenic m ice

3 討論

人5-LO基因定位于10號(hào)染色體q11.2亞帶,長(zhǎng)度超過(guò)82 kb,包含14個(gè)外顯子,被13個(gè)內(nèi)含子分隔開(kāi),分子量約為80×103。5-LO是生物機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)程的中樞酶,能夠產(chǎn)生具有信號(hào)調(diào)節(jié)功能的脂類(lèi)介質(zhì)白三烯——機(jī)體炎癥反應(yīng)中重要的活性生物分子,控制著白三烯及前列腺素酶等因子的生物合成鏈,特定引導(dǎo)白三烯家族炎性因子的生物合成通路[5]。在外來(lái)受體信號(hào)的誘導(dǎo)下5-LO在靜息的細(xì)胞內(nèi)與FLAP相結(jié)合,進(jìn)一步產(chǎn)生白三烯B4(LTB4)、白三烯C4(LTC4)、白三烯D4(LTD4)及白三烯E4(LTE4)等一系列炎性因子,5-LO主要在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞中表達(dá),同時(shí)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白三烯細(xì)胞膜受體,這樣白三烯分子與其受體在這些細(xì)胞表面以自分泌和旁分泌的形式相互作用,導(dǎo)致AS炎癥在血管內(nèi)壁上的發(fā)生和發(fā)展。來(lái)自臨床AS患病標(biāo)本的實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)證明5-LO存在于主動(dòng)脈、頸動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈的損傷的血管壁中,在AS發(fā)病的不同階段中, IV-V期患者血管壁中的5-LO+細(xì)胞數(shù)目高于II-III期患者,顯示5-LO+細(xì)胞數(shù)與AS病變程度正相關(guān)性,同時(shí)還檢測(cè)到5-LO通路中FLAP、LTA 4、LTC4等相關(guān)蛋白的存在[8]。血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中三種最主要的反應(yīng)細(xì)胞,但是白三烯炎癥因子及其受體是如何在三種反應(yīng)細(xì)胞中相互作用最終導(dǎo)致AS發(fā)生的炎癥反應(yīng)機(jī)制目前尚不完全清楚。為此,我們擬通過(guò)顯微注射的方法將外源5-LO基因?qū)胄∈蠡蚪M中建立5-LO過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠,以期在動(dòng)物整體水平上觀察研究5-LO蛋白過(guò)表達(dá)及其下游產(chǎn)物與AS發(fā)生發(fā)展的相互關(guān)系。

目前我們已經(jīng)利用顯微注射的方法獲得7只陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠,從Southern b lo t的檢測(cè)結(jié)果可以看出轉(zhuǎn)基因小鼠外源DNA已穩(wěn)定整合到基因組中, 5-LO轉(zhuǎn)基因小鼠與陰性對(duì)照小鼠的腹腔細(xì)胞、骨髓細(xì)胞的5-LO基因RT-PCR和W estern b lot檢測(cè)結(jié)果比較差異均有顯著(P<0.05),脾、腎組織的5-LO mRNA表達(dá)雖然高于正常小鼠,但是統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)顯著性,而脾、腎組織的5-LO蛋白表達(dá)高于正常小鼠且差異具有顯著性(P<0.05),轉(zhuǎn)基因小鼠間5-LO和FLAP表達(dá)檢測(cè)差異無(wú)顯著性,而且FLAP蛋白R(shí)T-PCR和W estern檢測(cè)結(jié)果與5-LO實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,與正常陰性對(duì)照小鼠比較差異亦有顯著性,也進(jìn)一步證明外源5-LO基因已在轉(zhuǎn)基因小鼠相應(yīng)組織內(nèi)表達(dá)。在圖2中可以看到轉(zhuǎn)基因小鼠Southern雜交帶為多條,不同轉(zhuǎn)基因小鼠間雜交帶有一定的差異,提示外源基因可能串聯(lián)重復(fù)序列整合入基因組或多位點(diǎn)整合,然而RT-PCR和W estern表達(dá)檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)基因小鼠間比較差異并無(wú)顯著性,提示外源5-LO基因的拷貝數(shù)可能對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠5-LO的表達(dá)之間可能沒(méi)有直接的關(guān)系,有待于做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)采用顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠,外源目的基因以隨機(jī)方式整合入小鼠基因組中,外源基因的整合位置或拷貝數(shù)可能影響轉(zhuǎn)基因小鼠繁育傳代,通過(guò)5-LO轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖傳代及RNA和蛋白水平實(shí)驗(yàn)檢測(cè)觀察,部分轉(zhuǎn)基因小鼠始終不孕,而9、20、24號(hào)轉(zhuǎn)基因小鼠均有子代陽(yáng)性小鼠,其中9號(hào)小鼠外源基因的表達(dá)最為穩(wěn)定,現(xiàn)已傳至F2代(結(jié)果待發(fā)表)。

綜上所述,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以判定已經(jīng)建立5-LO轉(zhuǎn)基因小鼠,為下一步藥物誘導(dǎo)5-LO轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)驗(yàn)研究打下了良好的基礎(chǔ)。

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Con struction of a 5-L ipoxygenase Tran sgen ic M ice

ZHANGM ei-ying,WU Hong-lian,YANGW ei,L I Zhao-yang,DONGW an-wei,ZHOU Sheng-lai, YU Yang,WANGW ei,LüX iang-chuan,Q IN Ying,ZHENG Zhi-hong,WANGLu-zeng
(Laboratory Anim al Center,ChinaM edicalUniversity,Shenyang 110001,China)

O b jective To construct a 5-lipoxygenase(5-LO)transgenic mouse model of atherosclerosis.MethodsPurified 5-LO fragm ent w as in jected into m ale p ronucli and the firtilized eggs were transp lanted into pseudop regnantm ice.PCR and Southern blotwere used to detect the genotype ofDNA separated from the newborn mouse tail tissues.RT-PCR andW estern b lot analysiswere used to detect the gene transcrip tion and exp ression.ResultsPCR and Southern blot results showed that 7 of 25 m ice were transgenic m ice.Exp ression of 5-LO and FLAP w as found in the bone m arrow,sp leen,kidney,and peritoneal cells.Resultsof RT-PCR and W estern blot show ed that No.9,20,24 transgenic m ice exp ressed a higher level of 5-LO and FLAP than those in the w ild type C57BL/6 m ice.The exp ression levels in bone m arrow and peritoneal cellswere significantly different(P<0.05).ConlusionA 5-LO transgenic mouse line has been estab lished in this study and m ay be used for future study on the function of 5-LO gene.

5-lipoxygenase;A therosc lerosis;Transgenic m ice

R711.75

A

1005-4847(2010)01-0060-05

2009-07-14

遼寧省高?？蒲许?xiàng)目計(jì)劃(2008S239);遼寧省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目(2008408002-2);國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)—藥物安全評(píng)價(jià)技術(shù)平臺(tái)建設(shè)(編號(hào):2008ZX09305-004)。

張梅英(1965-),女,研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因。E-m ail:zhm eiying@163.com