姚靜，方展強(qiáng)

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631)

研究報(bào)告

唐魚卵黃蛋白原的ELISA檢測(cè)方法的建立

姚靜，方展強(qiáng)

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631)

目的探索建立唐魚卵黃蛋白原的ELISA檢測(cè)方法。方法以卵黃脂磷蛋白(Lv)抗血清為抗體，以純化的Lv作為抗原建立間接酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)方法檢測(cè)雄性唐魚(Tanichthys albonubes)整體勻漿液中的卵黃蛋白原(Vtg)。結(jié)果利用ELISA方法測(cè)定了經(jīng)17－β雌二醇(E2)和不同濃度DDTs暴露21 d誘導(dǎo)的雄魚整體勻漿液中的Vtg含量，可以直接在1塊或在不同的酶標(biāo)板上準(zhǔn)確地進(jìn)行比較。經(jīng)0.055 mg/m L E2誘導(dǎo)的雄魚整體勻漿液中Vtg含量為4148.33 μg/g;當(dāng)暴露DDTs濃度為0.0275、0.0137和0.0067 mg/mL時(shí)，雄魚整體勻漿液中Vtg含量分別為1109.43、911.16和1322.79 μg/g，與丙酮溶劑對(duì)照組462.79 μg/g比較差異存在顯著性(P＜0.05)。結(jié)論建立了唐魚卵黃蛋白原的ELISA檢測(cè)方法，本方法的檢測(cè)靈敏度為8.1 ng/m L，批內(nèi)誤差為8.59%，批間誤差為6.28%，工作范圍為3.26～209.25 ng/mL。在該范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性和重復(fù)性。

卵黃脂磷蛋白;卵黃脂磷蛋白抗血清;酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng);唐魚

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disrupting chemicals，EDCs)對(duì)人類和野生動(dòng)物的有害效應(yīng)已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注。近年來(lái)，包括實(shí)驗(yàn)室內(nèi)及野外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都表明，檢測(cè)水生動(dòng)物體內(nèi)卵黃蛋白原的誘導(dǎo)產(chǎn)生是篩選EDCs以及評(píng)價(jià)水生動(dòng)物暴露于其中的潛在風(fēng)險(xiǎn)的有用工具［1］。酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)方法在蛋白質(zhì)的分析測(cè)定中應(yīng)用十分廣泛，該方法用于檢測(cè)卵黃蛋白原(vitellogenin，Vtg)具有方便易用、靈敏度高又沒(méi)有同位素污染，受到很多研究者的青睞。是目前最常用的Vtg檢測(cè)方法［2］。

唐魚(Tanichthys albonubes)隸屬鯉科亞科唐魚屬的一種小型魚類，生活在廣州及珠江三角洲地區(qū)。唐魚在室內(nèi)人工飼養(yǎng)良好條件下，壽命可達(dá)800日齡。目前的一些研究報(bào)道，重金屬和滴滴涕(DDTs)污染實(shí)驗(yàn)顯示，唐魚對(duì)污染物敏感，因此可作為生態(tài)毒理學(xué)研究的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［3，4］。本文研究以唐魚Lv抗血清為抗體，以Lv為抗原及標(biāo)準(zhǔn)品建立間接ELISA方法，并應(yīng)用該法檢測(cè)經(jīng)DDTs暴露處理的雄性唐魚體內(nèi)的Vtg含量，探索建立唐魚卵黃蛋白原的ELISA檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 藥品及儀器

17－β雌二醇(E2)(Sigma公司)，唐魚Lv和Lv抗血清(本實(shí)驗(yàn)室)，丙酮(分析純)，DDTs(美國(guó)Supelco公司)，酶標(biāo)儀(BioRed 680)，兔抗大鼠IgGHRP(武漢博士德生物工程公司)，TMB(MBchem產(chǎn)品)，BSA(Roche分裝)，其他試劑均為分析純。丙酮用作E2和DDTs的助溶劑，并用于溶劑對(duì)照實(shí)驗(yàn);DDTs用丙酮配制成0.22 mg/m L的母液，使用時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需濃度進(jìn)行稀釋;E2用于陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，用丙酮配制成1 mg/m L的母液，使用時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需濃度稀釋。

間接ELISA試劑及配制如下:①包被緩沖液(pH 9.6，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液):Na2CO31.59 g，NaHCO32.93 g，加蒸餾水定容至1000 m L。②洗滌緩沖液(pH 7.4，0.15 mol/L PBST):KH2PO40.2 g，Na2HPO42.9 g，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Tween－20 (0.05%)0.5 mL，加蒸餾水定容至1000 m L。③封閉液(1%BSA):BSA 0.1 g，加蒸餾水定容至10 m L。④終止液(2 mol/L H2SO4):蒸餾水178.3 m L，逐滴加入濃硫酸(98%)21.7 m L。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用唐魚(T.albonubes)取自本學(xué)院生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室培育的魚種，在室內(nèi)裝有水循環(huán)系統(tǒng)的水族缸內(nèi)培養(yǎng)并進(jìn)行人工繁殖至第3代，取5月齡性成熟的成魚個(gè)體［體重(0.27±0.04)g;體長(zhǎng)(3.29±0.17)cm］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)用水為充分曝氣24 h的自來(lái)水，水溫(26±1)℃，pH(6.8～7.2)，硬度約2.4度(德國(guó)度)。實(shí)驗(yàn)采用靜水法，在5000 m L燒杯中進(jìn)行，每燒杯加入1500 m L實(shí)驗(yàn)液，各放入雄性唐魚5尾，實(shí)驗(yàn)魚體重(0.27±0.04)g;體長(zhǎng)(3.29± 0.17)cm。在實(shí)驗(yàn)第10天徹底清換實(shí)驗(yàn)液一次，實(shí)驗(yàn)期間不喂食，自然光照，溫度條件不設(shè)控制，每天定時(shí)記錄水溫。實(shí)驗(yàn)設(shè)置丙酮溶劑對(duì)照組(0.25 m l/L);E2陽(yáng)性對(duì)照組(0.055 mg/m L)。參照唐魚仔魚的48 h半致死濃度0.049 mg/L［4］，設(shè)置DDTs暴露組:0.0550、0.0275、0.0137和0.0067 mg/mL。每組作3缸平行，共15尾。暴露開始第21天采集魚樣，稱量體重、體長(zhǎng)后，制作整體勻漿液用作ELISA檢測(cè)。

1.3.2 間接ELISA方法:操作步驟包括:①包被。用包被緩沖液將提純的唐魚Lv稀釋成不同質(zhì)量濃度，往酶標(biāo)板的每個(gè)孔中加入100 μL的Lv液，用微量振蕩器振蕩30 s以使Lv均勻分布，4℃過(guò)夜。②洗滌。取出酶標(biāo)板，棄去包被液，用洗滌緩沖液洗滌，每個(gè)孔加入280 μL的洗滌緩沖液PBST，3 min后將PBST傾倒，重復(fù)洗滌3次，洗后拍干。③封閉。在酶標(biāo)板上每孔加100 μL的1%BSA封閉液，37℃培養(yǎng)1 h后，洗滌3次。④洗板。傾倒封閉液，再按②的操作洗滌3次。⑤一抗。加入1∶500 Lv抗血清，每孔加入100 μL，37℃培養(yǎng)1 h。⑥洗板。傾倒Lv抗血清后，洗滌3次。⑦二抗。加入1∶1000酶標(biāo)二抗兔抗大鼠IGg－HRP:每孔加入100 μL，37℃培養(yǎng)1 h。⑧洗板。傾倒二抗液體，再按②的操作洗滌3次。⑨顯色。在每孔中加入TMB底物100 μL，室溫避光靜置30 m in后，每孔中加入50 μL終止液終止顯色。⑩在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的各孔A值。

1.3.3 抗血清和包被抗原最佳工作濃度篩選:抗血清和包被抗原最佳工作濃度篩選用棋盤滴定法測(cè)定［5］。Lv按不同的倍比濃度稀釋橫向包被酶標(biāo)板，按1.3.2節(jié)間接ELISA測(cè)定方法將不同濃度的抗血清橫向逐孔加入。在酶標(biāo)儀上讀出各孔A450值，比較A450值，將A450值在1.0左右的抗原抗體組合進(jìn)一步做標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定抗原最適包被濃度和血清的稀釋度。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作按間接ELISA方法進(jìn)行，Lv倍比稀釋成一系列濃度后包被酶標(biāo)板;4℃孵育過(guò)夜，陰性對(duì)照不包被Lv，直接加入包被液;Lv抗血清的濃度應(yīng)為最佳工作濃度;兔抗大鼠IGg－HRP的濃度為1∶1000。

1.3.5 樣品ρ(Vtg)的檢測(cè):用包被液將受試唐魚整體勻漿液稀釋至合適濃度進(jìn)行包被，按以上建立的間接ELISA方法進(jìn)行Vtg的定量分析。如果所檢測(cè)樣品中Vtg的含量超出了ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍時(shí)，則需先稀釋一定的倍數(shù)使之處于檢測(cè)范圍后再檢測(cè)，稀釋倍數(shù)依唐魚勻漿液樣品中Vtg的含量而不同。

2 結(jié)果

2.1 抗血清和包被抗原最佳工作濃度確定

對(duì)最適工作濃度評(píng)判的標(biāo)準(zhǔn)為陽(yáng)性孔的A450值約為1，陰性對(duì)照孔的A450值小于0.1，而抗原抗體濃度最低即為最適工作濃度。棋盤滴定的結(jié)果見表1。對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將A450值在1.0左右的抗原、抗體組合進(jìn)行比較后，選擇Lv抗血清的稀釋度為1∶1600、1∶3200及其中間值1∶2500等3個(gè)濃度再進(jìn)一步確定最佳的抗體濃度和標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍。Lv按837、418.5、209.25、104.62、52.31、26.15、13.07、6.53、3.26、1.63和0.81 ng/m L等11個(gè)倍比稀釋后濃度包被酶板，每個(gè)抗血清濃度在同一酶標(biāo)板上做3個(gè)重復(fù)。當(dāng)抗體濃度為1∶3200時(shí)，209.25 ng/m L與3.26 ng/m L之間曲線的靈敏度和檢測(cè)范圍較好，因此在ELISA檢測(cè)中采用1∶3200的抗體濃度。

表1 Lv與Lv抗血清棋盤滴定結(jié)果Tab.1 Results of the checkerboard titration of Lv and Lv antiserum

2.2 Lv標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以1∶3200為抗血清稀釋度，抗原包被濃度為209.25、104.62、52.31、26.15、13.07、6.53和3.26 ng/m L，按間接ELISA方法進(jìn)行測(cè)定。以A450值為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)Lv濃度為縱坐標(biāo)，用Microsoft Excel軟件作線性回歸圖(圖1)，得到一條回歸直線，回歸方程為y=705.29x－35.275，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。

2.3 測(cè)定唐魚Vtg的間接ELISA方法的質(zhì)量控制

2.3.1 方法的靈敏度:指該方法能檢測(cè)出的待測(cè)抗原的最低量，即最小檢出量。以相當(dāng)于陰性對(duì)照孔A450值2倍時(shí)的抗原濃度作為最小檢出量。從表2可知，當(dāng)Lv濃度達(dá)8.1 ng/m L時(shí)，其A450值與0 ng/ m L時(shí)的A450值出現(xiàn)明顯差異，P/N＞2.1，故檢出限為8.1 ng/m L。因此得到該方法的靈敏度為8.1 ng/m L。

圖1 1∶3200稀釋抗血清ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The calibration curve of the ELISA for the anti－Lv serum at 1∶3200 dilution

2.3.2 方法的精確度:該方法以批內(nèi)誤差和批間誤差來(lái)表示精確度。以標(biāo)準(zhǔn)曲線的批內(nèi)變異系數(shù)表示批內(nèi)誤差，變異系數(shù)CV=(SD/平均值)×100%。表3的結(jié)果顯示，各質(zhì)量濃度的批內(nèi)變異系數(shù)為1.408%～21.538%，平均為8.591%。批間誤差以批間變異系數(shù)表示，同一樣品在不同時(shí)間分3批進(jìn)行檢測(cè)，批間變異系數(shù)為0.872%～14.893%，平均為6.279%。批內(nèi)誤差和批間誤差均小于10%，基本達(dá)到ELISA方法的質(zhì)量控制要求。表明該方法在3.26～209.25 ng/m L范圍內(nèi)具有良好的線性和重復(fù)性。

表2 不同抗血清稀釋度下的Lv的濃度范圍及抗體濃度的篩選結(jié)果Tab.2 Range of different anti－Lv serum diluted concentrations and the screened results of antibody concentrations

表3 間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線批內(nèi)和批間誤差Tab.3 The intra－assay and inter－assay variability of the indirect ELISA calibration curves

2.4 樣品的檢測(cè)

采用上述建立的間接ELISA方法檢測(cè)了丙酮溶劑對(duì)照組、E2陽(yáng)性對(duì)照組和DDTs暴露組各實(shí)驗(yàn)組唐魚整體勻漿液樣品中的Vtg含量。其結(jié)果如表4所示。與丙酮溶劑對(duì)照組相比，E20.0550 mg/m L陽(yáng)性對(duì)照組的Vtg含量比溶劑對(duì)照組的高達(dá)將近9倍，表明了E2陽(yáng)性對(duì)照組的有效性。除了DDTs 0.055 mg/m L組之外，在低于LD50的濃度下，DDTs 0.0275 mg/m L，0.0137 mg/m L和0.0067 mg/m L等3個(gè)DDTs暴露組唐魚的Vtg含量都有明顯的增加，與丙酮溶劑對(duì)照組比較差異均具有顯著性(P＜0.05)，表明DDTs具有的類雌激素效應(yīng)，但是各組數(shù)據(jù)之間未呈現(xiàn)明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系。

表4 ELISA方法檢測(cè)經(jīng)DDTs和E2誘導(dǎo)唐魚的整體勻漿液中的Vtg結(jié)果Tab.4 The results of ELISA detection of the amount of Vtg in the whole fish homogenate of 17－β estradiol－and DDTstreated male T.albonubes for 21 days

3 討論

魚類血清中Vtg的定量測(cè)定方法有多種。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)因其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作方便、快速等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛應(yīng)用。目前已有大西洋鮭(Salmo salar)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)和劍尾魚(Xiphophorus helleri)等魚種用該方法建立了Vtg的ELISA檢測(cè)方法［6－9］。Lv是由Vtg在卵巢中經(jīng)過(guò)加工而形成的天然降解產(chǎn)物，免疫印跡結(jié)果顯示，在自然狀態(tài)下，Lv抗血清與Vtg有良好的交叉反應(yīng)。已經(jīng)證明劍尾魚的Lv抗血清與Vtg有良好的交叉反應(yīng)，而且，Lv在卵中有很高的含量，比Vtg更容易獲得［10］。因此可以用Lv代替Vtg作為ELISA的標(biāo)準(zhǔn)品，用Lv抗血清代替Vtg抗體，建立ELISA方法。最近的研究結(jié)果顯示，天然狀態(tài)下唐魚的Lv及其大分子亞基抗血清都能和Lv及Vtg發(fā)生特異性交叉反應(yīng)。這表明除了天然狀態(tài)下的Lv之外，其大分子亞基和Vtg同樣具有相同的免疫原性。并且在純化過(guò)程中，Lv的大分子亞基穩(wěn)定性高于天然狀態(tài)下的Lv。因此，以Lv的大分子亞基代替Vtg作為抗原，對(duì)Vtg進(jìn)行檢測(cè)，是可行的［11］。本研究中以Lv作為抗原和標(biāo)準(zhǔn)物建立Vtg檢測(cè)的間接ELISA方法，包括抗原最佳工作濃度篩選、ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)濃度為3.26～209.25 ng/m L，靈敏度為8.1 ng/mL，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證，批內(nèi)誤差為8.59%，批間誤差為6.28%，均小于10%，與其他研究者的報(bào)道相近［12］，符合ELISA實(shí)驗(yàn)方法的要求。說(shuō)明在此范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性和重復(fù)性。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)目前的生態(tài)毒理學(xué)研究是十分有意義的。對(duì)于小型實(shí)驗(yàn)魚類來(lái)說(shuō)，由于其血量少，采集困難，所以難以從中提取Vtg用作免疫分析。Lv是魚卵中的主要蛋白質(zhì)，并且可以較容易地從卵巢中獲取足夠的量。因此，以Lv或Lv大分子亞基代替Vtg作為抗原，除了可以解決難以大量獲取的問(wèn)題以外，還能克服Vtg極易降解的難題。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用間接ELISA方法分析經(jīng)不同濃度DDTs處理過(guò)的雄性唐魚體內(nèi)的Vtg含量，結(jié)果表明，在DDTs濃度0.0067～0.0275 mg/m L的暴露組中，雄性唐魚體內(nèi)的Vtg含量有不同程度的明顯增加。雖然有些報(bào)道認(rèn)為DDTs并不與魚類的雌激素受體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，但通過(guò)重組人類雌激素受體(HER)基因酵母細(xì)胞來(lái)檢測(cè)DDTs雌激素活性的研究結(jié)果證明，DDTs是一類可直接像配體一樣與雌激素受體接合的EDCs，其中o，p′－DDT的雌激素活性最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果支持DDT具有雌激素活性的結(jié)論［13］。同時(shí)也證明唐魚對(duì)DDTs有一定的敏感性，適合作為監(jiān)測(cè)環(huán)境EDCs的標(biāo)識(shí)物。此外，從DDTs對(duì)唐魚誘導(dǎo)所產(chǎn)生的Vtg量與由E2誘導(dǎo)所產(chǎn)生的量作比較表明，DDT具有雌激素性質(zhì)，但活性相對(duì)比較低，推測(cè)可能是由雌激素受體介導(dǎo)的。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在濃度為0.055 mg/mL DDTs的暴露組中，唐魚體內(nèi)的Vtg含量不僅沒(méi)有明顯增加，反而比溶劑對(duì)照組略有減少。解釋這一現(xiàn)象，初步認(rèn)為這可能是由于DDTs的濃度已經(jīng)超過(guò)了唐魚的安全濃度，唐魚中毒后其肝細(xì)胞將受損，蛋白質(zhì)合成功能受阻，導(dǎo)致魚體內(nèi)Vtg含量下降。

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Developm ent and App lication of an ELISA Technique for Detecting Tanichthys albonubes Vitellogenin

YAO Jing，F(xiàn)ANG Zhan－qiang
(Key Laboratory of Ecology and Environmental Science in Guangdong Higher Education，College of Life Sciences，South China Normal University，Guangzhou 510631，China)

ObjectiveThe aim of this study was to set up an indirect enzyme－linked immunosorbent assay (ELISA)for detecting Tanichthys albonubes vitellogenin.M ethods ELISA was established for detecting Vtg in the whole body homogenate(WBH)of male T.albonubes.The technique was developed with antiserum against lipovitellin(Lv)as antibody and Lv as antigen.Results Adult male T.albonubes was exposed to nominal water(control group)，to DDTs at concentrations of 0.0275 mg/m L，0.0137 mg/m L and 0.0067 mg/m L(DDTs exposure groups)and to 17－β estradiol at concentration of 0.0550 mg/mL(E2exposure group)in a static exposure system for 21 days.WBH samples of male fish could be checked in the same one coated well and different coated wells to develop screening of environmental estrogen. Compared with control group(462.79 μg/g)，the Vtg concentrations in DDTs exposure groups(1 109.43 μg/g，911.16 μg/g，and 1 322.79 μg/g，respectively)and E2exposure group(4 148.33 μg/g)were significantlyly different(P＜0.05).ConlusionAn ELISA assay for detecting T.albonubes vitellogenin has been set up.The working range is 3.26 to 209.25 ng/mL，the sensitivity is 8.1 ng/m L，the intra－assay and inter－assay coefficients of variation are 8.59%and 6.28%，respectively.This technique shows a good linearity and repeatability in standard curves.

lipovitellin;Anti－lipovitellin(Lv)serum;ELISA;Tanichthys albonubes

X171.1

A

1005－4847(2010)03－0242－05

2009－10－22

珠海市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):PC20081050)和廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):2009B030600006)。

姚靜(1981－)，女，研究方向:水生態(tài)毒理學(xué)。E－mail:yyspirit@hotmail.com.

方展強(qiáng)。E－mail:fangzhq@scnu.edu.cn.