王學(xué)斌，馮潔，楊玉琴，謝建云，陳國宏

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009;2.上海實驗動物研究中心，上海市實驗動物質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，上海 201203;3.復(fù)旦大學(xué)，上海 200032)

綜述·進(jìn)展

研究報告

PEPCK不同啟動子調(diào)控報告基因表達(dá)效率的比較

王學(xué)斌1，馮潔2，楊玉琴3，謝建云2，陳國宏1

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009;2.上海實驗動物研究中心，上海市實驗動物質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，上海 201203;3.復(fù)旦大學(xué)，上海 200032)

目的構(gòu)建兩種不同的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因啟動子調(diào)控報告基因表達(dá)質(zhì)粒，比較該啟動子在各種細(xì)胞系中的表達(dá)效率。方法采用PCR克隆大鼠PEPCK啟動子1323 bp和560 bp兩條片段，將兩個PEPCK啟動子片段插入pGL4.26－Luc2報告質(zhì)粒中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到肝臟細(xì)胞系和脂肪細(xì)胞系，以非脂肪或肝臟細(xì)胞系做對照，比較PEPCK驅(qū)動熒光素酶表達(dá)效率。結(jié)果通過酶切鑒定及基因測序，證明pGL4.26－PEPCK－Luc2熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，且能夠在體外表達(dá)熒光素酶。結(jié)論兩種同片段的PEPCK啟動子在各細(xì)胞系中的表達(dá)效率差異無顯著性。

重組質(zhì)粒;表達(dá)效率;磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)能催化草酰乙酸(oxaloacetate，OAA)轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，是體內(nèi)糖異生作用中第一個關(guān)鍵酶，其調(diào)節(jié)主要在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平。PEPCK基因在肝、腎、褐色脂肪和白色脂肪中高表達(dá)［1］。其表達(dá)受多種激素和第二信使的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)，其中包括胰島素、糖皮質(zhì)激素、維甲酸、甲狀腺素、環(huán)磷脂酸腺苷［2］。PEPCK基因轉(zhuǎn)錄的組織特異性是由激素和飲食調(diào)控的。例如:PEPCK在肝臟中的表達(dá)和血糖濃度有關(guān)，在腎臟中的表達(dá)主要受體質(zhì)的酸/堿比例調(diào)控。在肝臟和腎臟中，糖皮質(zhì)激素刺激其表達(dá)，而環(huán)磷酸腺苷和胰島素抑制其表達(dá)。在脂肪組織中，糖皮質(zhì)激素則抑制其表達(dá)。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)雜性使PEPCK基因成為研究激素相關(guān)和基因表達(dá)組織特異性的有力模型，目前國際上已經(jīng)研究出包括PEPCK啟動子區(qū)域－888～+ 69序列構(gòu)建的載體可以在肝、腎和小腸中特異性表達(dá)并且受激素和飲食的調(diào)控。然而PEPCK啟動子區(qū)域在脂肪組織中特異性表達(dá)的報道則極少，Jerry等在1999年利用轉(zhuǎn)基因小鼠證明PEPCK啟動子區(qū)域－1242～828為脂肪特異的增強子，這個增強子可作為PEPCK在脂肪中特異表達(dá)的啟動子［3］。所以我們選定PEPCK啟動子區(qū)域－1254～+69作為在脂肪中的特異表達(dá)啟動子，采用熒光素酶表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建PEPCK－1254～+69啟動子調(diào)控的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，同時構(gòu)建PEPCK－488～+69核心啟動子區(qū)域調(diào)控的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒作為對照［4］。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染到肝臟細(xì)胞系和脂肪細(xì)胞系，以非脂肪或肝臟細(xì)胞系做對照，比較PEPCK驅(qū)動熒光素酶表達(dá)效率。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和載體

BRL－3A大鼠肝細(xì)胞株、3T3－L1脂肪前體細(xì)胞株購于中科院生化細(xì)胞所。HEK－293細(xì)胞株、SHSY5Y細(xì)胞株BMC細(xì)胞株、pGL4.26－Luc2(連接熒光素酶報告基因Luciferase)、PCDNA3.1－Luc2為華東師范大學(xué)腦功能基因組研究所保存。pMD18－T載體購于TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

本實驗克隆所用的內(nèi)切酶、T4連接酶、高保真Taq酶、Trizol、RT－PCR試劑盒均購自TaKaRa公司; M1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司;Lipofectin2000購自Invitrogen公司;熒光素酶測定試劑盒購自Promega公司。

1.3 pGL4.26-PEPCK-Luc2載體的構(gòu)建

以大鼠基因組DNA為模版，在PEPCK啟動子－488～+69設(shè)計引物:

同時在PEPCK啟動子－1254～+69設(shè)計引物:

經(jīng)PCR擴(kuò)增，回收產(chǎn)物大小為560 bp和1323 bp的片段，回收PCR產(chǎn)物鏈接到pMD18－T載體中，測序。利用pMD－18T載體上Kpn I位點和PEPCK啟動子3′端Bgl II位點進(jìn)行雙酶切，同時用上述兩個酶雙切pGL4.26，酶切產(chǎn)物回收、鏈接、轉(zhuǎn)化、克隆篩選得到pGL4.26－PEPCK－Luc2載體。

1.4 pGL4.26-PEPCK-Luc2載體熒光素酶表達(dá)活性的鑒定

用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pGL4.26－PEPCKLuc2分別轉(zhuǎn)染BRL－3A、3T3－L1、SHSY5Y、293、MBMC細(xì)胞株。為了驗證脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的最佳轉(zhuǎn)染效率，脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例分別為1∶0.5、1∶2.5和1∶5。具體步驟為:①將密度為2.5×105的細(xì)胞接種到96孔板，待細(xì)胞融合到90%～95%。②25 μL Opti－MEM分別稀釋質(zhì)粒和0.4 μL的脂質(zhì)體，室溫放置5 min。③稀釋好的脂質(zhì)體和質(zhì)?；靹?，室溫放置20 min。④混合液加入到含100 μL Opti－MEM培養(yǎng)基的細(xì)胞孔中于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h后換含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5 熒光素酶活性的測定

轉(zhuǎn)染24 h后，各細(xì)胞孔加100 μL熒光素酶裂解液，以含有CMV啟動子的PCDNA－Luc2做為熒光素酶表達(dá)效率對照，三種比例的的轉(zhuǎn)染液比較轉(zhuǎn)染效率，在酶標(biāo)儀上測定熒光素酶的活性。所有的實驗數(shù)據(jù)都取4個樣品的平均值，每個實驗重復(fù)2次。

2 結(jié)果

2.1 PEPCK啟動子PCR擴(kuò)增結(jié)果

由PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖可以看出，兩對引物分別在預(yù)期的560 bp和1323 bp處出現(xiàn)明顯DNA片段(圖1)，無明顯非特異性條帶。PEPCK啟動子與pMD18－T載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)DH5a轉(zhuǎn)化之后，克隆后經(jīng)酶切鑒定條帶與預(yù)計條帶大小相符，測序結(jié)果經(jīng)Blast對比與大鼠PEPCK基因序列完全相符。

2.2 含PEPCK啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒的酶切鑒定及測序

1:長片段PEPCK PCR產(chǎn)物;3、4:短片段PEPCK PCR產(chǎn)物;M:DL2000 marker;2、5:空白對照圖1長、短兩個段片段PEPCK擴(kuò)增結(jié)果Note:1:PEPCK－long fragment product;2，4:PEPCK－short fragment product;M:DL2000 marker;2，5: Negative controlFig.1 The results of PCR amplification of the genom ic DNA of PEPCK long and short fragments

重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化后挑取克隆經(jīng)過酶切鑒定(圖2)。測序結(jié)果經(jīng)Blast對比證實完全正確。說明含PEPCK啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1:長片段的PEPCK重組質(zhì)粒;2:短片段的PEPCK重組質(zhì)粒;3: Kpn I+Bgl II酶切pGL4－PEPCK－short;5:Kpn I+Bg lII酶切pGL4－PEPCK－long;M:DL2000 marker;4、6:空白對照圖2兩種pGL4－PEPCK－Luc2質(zhì)粒的酶切鑒定Note:1:pGL4－PEPCK－long;2:pGL4－PEPCK－short;M:DNA maker (DL2000);3:pGL4－PEPCK－short digested with Kpn I+Bgl II;5: pGL4－PEPCK－long digested with Kpn I+Bgl II;4，6:Negative control.Fig.2 Identification of the recombinant pGL4－PEPCK－long and pGL4－PEPCK－short by restriction enzyme digestion

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和熒光素酶活性的測定

重組質(zhì)粒pGL4－PEPCK－Luc2分別瞬時轉(zhuǎn)染脂肪前體細(xì)胞系3T3－L1和大鼠肝細(xì)胞系BRL－3A，用非脂肪細(xì)胞和非肝臟細(xì)胞系SHSY5Y、293、MBMC細(xì)胞系作為對照，比較PEPCK驅(qū)動熒光素酶表達(dá)效率。以強啟動子CMV作為PEPCK啟動子效率表達(dá)的對照組，為了驗證脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的最佳轉(zhuǎn)染效率，脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例分別為1∶0.5、1∶2.5和1∶5。結(jié)果CMV啟動子的轉(zhuǎn)染效率在各種細(xì)胞系都是脂質(zhì)體與質(zhì)粒比例為1∶2.5時最高。長、短兩個片段的PEPCK啟動子在BRL－3A、3T3－L1和MBMC細(xì)胞系中在1∶2.5時轉(zhuǎn)染效率最高，在其他兩個細(xì)胞系中以1∶0.5時轉(zhuǎn)染效率最高。從圖3可以看出，以CMV為對照的兩個PEPCK啟動子表達(dá)效率，在肝細(xì)胞系BRL－3A中表達(dá)效率最高，在HEK－293細(xì)胞系中表達(dá)最低。短片段的PEPCK啟動子在各細(xì)胞系中表達(dá)都比長片段的表達(dá)效率要高，只有在HEK－293細(xì)胞系中長片段表達(dá)效率高于短片段啟動子，且存在顯著性差異。

圖3 不同PEPCK啟動子轉(zhuǎn)染各細(xì)胞系后表達(dá)效率比較(%)Fig.3 Comparison of the expression efficiency in different cell lines after pGL4－PEPCK－long and pGL4－PEPCK－short transfection.*P＜0.05: compared with pCMV－luc2

3 討論

對于PEPCK基因啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，國內(nèi)外已經(jīng)做了很細(xì)致的研究，在PEPCK啟動子－1000～+1區(qū)域可分為四個功能區(qū)［5］:區(qū)域一包括TATA盒、CAAT盒區(qū)域和環(huán)磷酸腺苷調(diào)節(jié)元件(CRE)的啟動子區(qū)域。區(qū)域二包括肝細(xì)胞核因子－1 (HNF－1)結(jié)合位點、CAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/ EBP)結(jié)合區(qū)域和甲狀腺素調(diào)節(jié)元件(TRE);區(qū)域三由一個皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)單位(GRU)組成，包括兩個糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)(GRE)元件，一個胰島素調(diào)節(jié)元件(IRE)，一個維甲酸受體(RARE)結(jié)合區(qū)域和兩個肝細(xì)胞核因子(HNF)3輔助因子(AF)結(jié)合區(qū)域;區(qū)域四一直延伸到啟動子區(qū)域－1000包括兩個過氧化物酶激活受體γ2(PPARγ2)結(jié)合位點在－451～－439和－999～－987區(qū)域。后者的結(jié)合位點是PEPCK基因在脂肪組織中特異性表達(dá)結(jié)合位點［6］。

目前研究PEPCK基因多借助靈敏度及重復(fù)性較好的熒光素酶報告系統(tǒng)取代以同位素作為測定標(biāo)識、檢測時間長、分析靈敏度不高的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶報告系統(tǒng)［7］。本研究通過對重組pGL4.26－PEPCK－Luc2酶切鑒定、測序鑒定以及在細(xì)胞內(nèi)瞬時表達(dá)表明成功構(gòu)建PEPCK兩個不同啟動子片段的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒。其中PEPCK基因的調(diào)控元件多位于560 bp短片段啟動子區(qū)域，為PEPCK基因的核心啟動子區(qū)域，長片段的啟動子區(qū)域在此基礎(chǔ)上延伸到－1254 bp，包含兩個過氧化物酶激活受體γ2((PPARγ2)結(jié)合位點，而這兩個位點是正是PEPCK基因在脂肪組織中特異性表達(dá)結(jié)合位點［6］。將這兩個質(zhì)粒用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞系BRL－3A和脂肪前體細(xì)胞系3T3－L1，用非脂肪和非肝臟細(xì)胞系SHSY5Y、HEK－293、MBMC作為對照。在肝臟細(xì)胞系BRL－3A中，兩個PEPCK啟動子片段的表達(dá)效率高于其他細(xì)胞系。長、短兩個片段的PEPCK啟動子區(qū)域在脂肪前體細(xì)胞系3T3－L1系中表達(dá)效率沒有顯著性差異。在各種細(xì)胞系中560 bp短片段啟動子區(qū)域要比1336 bp長片段啟動子區(qū)域表達(dá)稍高，但沒有顯著性差異。說明在調(diào)控過程中是－488～+69約560 bp的短片段啟動子其主要調(diào)控作用，并且有文獻(xiàn)報道PEPCK啟動子調(diào)控載體在各組織的特異性表達(dá)受飲食和激素的調(diào)控，這也可能是表達(dá)效率沒有顯著性差異的原因之一。不過在HEK－293細(xì)胞系中長片段啟動子區(qū)域表達(dá)高于短片段，且有顯著性差異。同時鑒定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法不同比例下的轉(zhuǎn)染效率得出長、短兩個片段的PEPCK啟動子在BRL－3A、3T3－L1和MBMC細(xì)胞系中在1∶2.5時轉(zhuǎn)染效率最高，在其他兩個細(xì)胞系中以1∶0.5轉(zhuǎn)染效率最高，實驗結(jié)果差異可能與細(xì)胞系、培養(yǎng)條件及細(xì)胞狀態(tài)的不同有關(guān)。

目前國際上對PEPCK啟動子在肝臟、腎、小腸中特異性表達(dá)有了詳盡的報道，而在脂肪組織中特異性表達(dá)的PEPCK啟動子序列的報道很少。對于在脂肪組織中特異表達(dá)的PEPCK啟動子區(qū)域還不確定，Eisenberger等［8］在1992年將大鼠PEPCK基因5′端2.2 kb的序列轉(zhuǎn)入小鼠，發(fā)現(xiàn)在－2086～ 888這段序列在脂肪組織中表達(dá)。Jerry等在1999年利用轉(zhuǎn)基因小鼠證明PEPCK啟動子區(qū)域－1242～828為脂肪特異的增強子［3］。本研究就是選定PEPCK啟動子的－1254～+69區(qū)域1 336 bp和－488～+69區(qū)域約560 bp的調(diào)控序列，采用熒光素酶報告系統(tǒng)比較PEPCK不同啟動子調(diào)控報告基因表達(dá)效率，實驗證明PEPCK啟動子的－1254～+69和－488～+69這兩段序列可調(diào)控報告基因表達(dá)，但表達(dá)效率沒有顯著性差異。

［1］JD.Horton，I.Shimomura，MS.Brown，et al.Activation of cholesterol synthesis in preference to fatty acid synthesis in liver and adipose tissue of transgenic mice overproducing sterol regulatory element－binding protein－2［J］.J Clin Invest，1998，101:2331－2339.

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Com parison of the Expression Efficiency of Two Different Recom binant Firefly Luciferase Reporter Plasm ids pGL4-PEPCK-Luc2

WANG Xue－bin1，F(xiàn)ENG Jie2，YANG Yu－qin3，XIE Jian－yun2，CHEN Guo－h(huán)ong1
(1.College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China; 2.Shanghai Quality Monitoring Center of Laboratory Animals，Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai 201203，China;3.Fudan University，Shanghai 200032，China)

ObjectiveTo construct two different luciferase reporter p lasmid pGL4.26－PEPCK－Luc2，and to evaluate the expression efficiency of the phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK)gene promoters in several cell lines in vitro.M ethods Two PEPCK promoter fragments 1323 bp and 560 bp were obtained from rat genomic DNA by PCR，and the fragments were inserted in pGL4.26－Luc2 luciferase reporter plasmid.Then the recombinant plasmid was transfected into hepatoma and adipocyte cell lines to compare the PEPCK driven luciferase expression efficiency.Results

Restriction enzyme digestion and nucleotide sequencing conformed that the coupling site of the recombinant was correct without base mutation and deletion.The luciferase was expressed in the cell lines transfected with different plasmids pGL4. 26－PEPCK－Luc2.ConlusionThe expression efficiency of the two different PEPCK promoters in various cell lines has no significant difference.

Recombinant plasmid;Expression efficiency;Phosphoenolpyruvate carboxykinase

R349.64

A

1005－4847(2010)03－0225－04

2009－09－18

綜述·進(jìn)展

上海市科學(xué)基因資助項目(071409001)。

王學(xué)斌(1985－)，男，碩士，研究方向，特種經(jīng)濟(jì)動物飼養(yǎng)。E－mail:mars8001)558@126.com

謝建云(1968－)，女，研究員，主要從事實驗動物遺傳學(xué)研究。E－mail:xiejianyun@hotmail.com