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        低劑量雙酚A灌胃對去卵巢小鼠子宮的增生作用

        2010-09-09 09:20:14吳建輝楊榮富徐瀅雯王玖玖劉向云劉桂明何桂林孫祖越
        中國實驗動物學(xué)報 2010年2期
        關(guān)鍵詞:子宮腔去勢雌二醇

        吳建輝,楊榮富,徐瀅雯,王玖玖,劉向云,劉桂明,何桂林,孫祖越

        (1.復(fù)旦大學(xué),上海200433;

        2.中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心,上海市計劃生育科學(xué)研究所藥理毒理學(xué)研究室,上海 200032)

        研究報告

        低劑量雙酚A灌胃對去卵巢小鼠子宮的增生作用

        吳建輝1,2,楊榮富2,徐瀅雯2,王玖玖2,劉向云2,劉桂明2,何桂林2,孫祖越2

        (1.復(fù)旦大學(xué),上海200433;

        2.中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心,上海市計劃生育科學(xué)研究所藥理毒理學(xué)研究室,上海 200032)

        目的觀察小鼠經(jīng)消化道途徑給予低劑量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A對子宮的作用及機制。方法雌性ICR小鼠切除雙側(cè)卵巢,恢復(fù)性飼養(yǎng)1周,剔除異常個體后,50只動物隨機分成5組,每組10只動物,依次皮下注射(sc)10.0 μg/(kg·d)17β-雌二醇,灌胃(ig)0、20.0、60.0和180.0 μg/(kg·d)BPA,連續(xù)7 d。動物每3d稱量體重一次,于最后一次給藥24 h后,陰道涂片檢測角化上皮細胞,頸椎脫臼處死動物,取子宮,稱其干濕重,計算子宮臟器指數(shù),組織切片,HE染色后利用圖像分析系統(tǒng)測量子宮上皮高度和宮腔面積。免疫組化法分析子宮雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)表達。結(jié)果①與對照組相比,雌二醇和BPA低劑量組動物體重增加,BPA中高劑量組動物體重?zé)o明顯差異。②陰道涂片結(jié)果顯示,處于動情期動物數(shù)分別為:對照組0/10,雌二醇組10/10,BPA低劑量組2/10,BPA中劑量組1/10,BPA高劑量組0/10;③BPA低劑量組動物子宮濕重和含水量較對照組增加,臟器系數(shù)增大,BPA中高劑量組子宮濕重和臟器系數(shù)較對照組降低明顯(P<0.05);④病理組織學(xué)及顯微圖像分析結(jié)果顯示,BPA低劑量組動物子宮腔面積較對照組增大,中高劑量組子宮腔面積明顯減小(P<0.01);低劑量組動物子宮上皮高度較對照組增高(P<0.01),中高劑量組子宮上皮高度降低明顯(P<0.01)。⑤免疫組化結(jié)果顯示,低劑量BPA能增強小鼠子宮ER和PR表達,但隨劑量增加,ER表達下降。結(jié)論BPA經(jīng)消化道途徑給予ICR小鼠,人環(huán)境暴露劑量下具有雌激素活性,但雌激素活性隨BPA劑量增大呈現(xiàn)下降趨勢。

        雙酚A(BPA);雌激素活性;子宮;小鼠

        雙酚A(BPA)是制造聚碳酸脂、環(huán)氧樹脂等的前體物,廣泛應(yīng)用于食品包裝、飲料容器等日常生活塑料制品的生產(chǎn),可通過食品包裝容器或塑料薄膜滲入食品或飲料進入人體。其化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素類似,認為具有弱的雌激素活性,系環(huán)境雌激素的一種[1]。目前對BPA是否具有胚胎毒性還存在爭議,但一些動物實驗已證示BPA對雄性生殖系統(tǒng)具有直接毒性作用,實驗結(jié)果尤其提示環(huán)境暴露劑量下,BPA可能對男性生殖系統(tǒng)存在較為明顯毒性作用[2-4]。綜合目前已公開報道的有關(guān)BPA雌激素活性的文獻,BPA的給予方式主要包括:體外直接作用于細胞;皮下注射大劑量給予動物[5];或整體大劑量給予動物,最高劑量達800 mg/kg[6],結(jié)論均認為BPA雌激素活性隨劑量增加而增強。日常生活中,人體主要通過消化道途徑接觸BPA,環(huán)境暴露BPA的劑量為1 μg/kg[7]。在這種低劑量暴露情況下,BPA的雌激素活性如何?是否也呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系?目前尚無文獻對BPA低劑量狀態(tài)的雌激素活性進行探討。新近的研究報道提示,低劑量的BPA具有雄性生殖毒性,尤其表現(xiàn)為對前列腺的影響,這種毒性表現(xiàn)是否與低劑量BPA異常雌激素活性有關(guān)?本文旨在探討模擬人體環(huán)境暴露途徑情況下,低劑量BPA的雌激素活性及原因,為進一步探討B(tài)PA與前列腺增生關(guān)系研究提供理論基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 動物

        ICR雌性小鼠,體重18~20 g,購自斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2007-0005]。

        1.2 藥物

        雙酚A(bisphenol A),含量95%,批號162k0715,Sigma公司生產(chǎn),以0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC)均勻分散供試品;17β-雌二醇(17βestradiol),含量97%,批號23607072,Sigma公司生產(chǎn),橄欖油溶解。

        1.3 儀器

        PM 600型電子天平,Switzerland產(chǎn);BH-2型顯微鏡,日本Olympus公司;Motic Images Advanced 3.2顯微圖像分析軟件,Motic中國有限公司。

        1.4 動物處理及給藥

        動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后,麻醉狀態(tài)下切除雙側(cè)卵巢,恢復(fù)性飼養(yǎng)1周,連續(xù)5 d作陰道涂片,剔除出現(xiàn)動情反應(yīng)的個體。符合要求的動物按體重隨機分為5組,依次分設(shè)對照組、雌二醇組和BPA低、中、高三個劑量組,每組10只動物。雌二醇組動物皮下注射10.0 μg/(kg·d)17β-雌二醇,BPA組動物依次灌胃給予20.0、60.0和180.0 μg/(kg·d)BPA,連續(xù)7 d,對照組動物灌胃給予等體積溶媒。動物每3d稱量體重一次,于最后一次給藥24 h后,陰道涂片檢測角化上皮細胞,染色拍照,頸椎脫臼處死動物。

        1.5 子宮病理組織學(xué)觀察及上皮高度與子宮腔面積分析

        取子宮,修去子宮周圍脂肪,稱其濕重,計算子宮臟器系數(shù),其中一半子宮組織置80℃干燥24h后,稱量干重,另一半子宮組織置10%福爾馬林溶液固定,病理切片,HE染色后,光學(xué)顯微鏡下觀察子宮形態(tài)學(xué)變化,并利用圖像分析系統(tǒng)測量子宮內(nèi)膜上皮高度和子宮腔面積。

        1.6 免疫組織化學(xué)法檢測子宮雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)表達

        子宮組織經(jīng)10%中性福爾馬林液固定后,石蠟包埋,4 μm切片,按武漢博士德生物工程有限公司提供的試劑盒使用說明,SABC免疫組化法檢測子宮組織ER和PR受體表達,其中,ER和PR抗體按1∶100稀釋。每組選6個標(biāo)本,每張組織切片觀察5個視野,利用圖像分析軟件分析平均吸光度值,分析ER和PR的表達程度。

        1.7 統(tǒng)計方法

        借助SPSS11.5統(tǒng)計軟件,根據(jù)數(shù)據(jù)性質(zhì)進行相關(guān)分析,計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,進行方差分析檢驗后,再進行組間兩兩比較。

        2 結(jié)果

        2.1 給予BPA后ICR小鼠體重變化

        去勢ICR小鼠恢復(fù)性飼養(yǎng)一周后,灌胃給予BPA,各組動物平均體重均呈增長趨勢,其中,雌二醇組動物體重增長最為明顯,至給藥后第8天,BPA低劑量組動物平均體重高于中高劑量BPA組和對照組,BPA中劑量組動物平均體重略低于對照組(圖1)。

        2.2 BPA對ICR小鼠動情周期影響

        ICR小鼠給予BPA 7 d后,陰道涂片經(jīng)Giemsa染色,顯微鏡下觀察顯示,處于動情期的ICR小鼠數(shù)量隨BPA劑量增加而減少,雌二醇組動物均處于動情期,對照組動物多數(shù)處于動情后期和動情間期(表1)。

        圖1 BPA對去勢ICR雌性小鼠體重影響Fig.1 Effects of BPA on the body weight of ovariectomized female ICR mice

        表1 BPA對去勢ICR小鼠動情周期影響(n=10)Tab.1 Effects of BPA on estrous cycle of ovariectomized ICR m ice(n=10)

        2.3 BPA對ICR小鼠子宮重量及含水量影響

        ICR小鼠給予BPA后,低劑量組動物子宮平均重量和組織平均含水量增加,臟器系數(shù)增大,與雌二醇組相當(dāng)。隨BPA劑量增加,動物子宮重量和子宮臟器系數(shù)降低(P<0.05),子宮組織平均含水量降低(表2)。

        表2 BPA對去勢ICR小鼠子宮重量及含水量影響(x±s,n=10)Tab.2 Effects of BPA on the uterus weight and water content in the ovriectom ized ICR mice(±s,n=10)

        表2 BPA對去勢ICR小鼠子宮重量及含水量影響(x±s,n=10)Tab.2 Effects of BPA on the uterus weight and water content in the ovriectom ized ICR mice(±s,n=10)

        注:*P<0.05,**P<0.01 vs.對照組Note:*P<0.05,**P<0.01 compared with the control group.

        組別Group體重(g) Body weight子宮重量(g) Uterus weight含水量(/100) Uterus water content(/100)臟器系數(shù)(/100) Organ coefficient(/100)對照組Control group 27.5±2.4 0.11±0.02 79.9±5.7 0.41±0.10雌二醇組E2 group 31.2±1.5**0.18±0.03**81.0±3.1 0.59±0.11**BPA低劑量20 μg/kg BPA 28.5±2.2 0.15±0.04 80.9±2.6 0.52±0.15 BPA中劑量60 μg/kg BPA 27.2±3.0 0.07±0.04*58.9±13.1*0.26±0.13*BPA高劑量180 μg/kg BPA 27.7±2.1 0.08±0.01*74.7±11.4 0.28±0.05*

        2.4 BPA對ICR小鼠子宮形態(tài)學(xué)影響

        去勢ICR小鼠給予BPA 7 d后,BPA低劑量組動物子宮腔面積增大,子宮上皮增生明顯(P<0.01),而BPA高劑量組動物子宮腔面積縮小(P<0.01),子宮上皮萎縮。鏡下顯示,BPA低劑量組子宮腔內(nèi)上皮增生突出,隨BPA劑量增加,子宮腔面積縮小,子宮上皮萎縮。見表3,圖2(見彩插9)。

        表3 BPA對去勢ICR小鼠子宮腔及子宮上皮高度影響(±s)Tab.3 Effects of BPA on the uterine luminal surface area and the height of endometrial epithelium in the ovariectom ized ICR mice(±s)

        表3 BPA對去勢ICR小鼠子宮腔及子宮上皮高度影響(±s)Tab.3 Effects of BPA on the uterine luminal surface area and the height of endometrial epithelium in the ovariectom ized ICR mice(±s)

        注:*P<0.05,**P<0.01 vs.對照組Note:*P<0.05,**P<0.01,compared with the control group.

        組別Group子宮腔面積Area of Uterine cavity (n=10,μm2)子宮上皮Height of Endometrium (μm,n=50)對照組Control group 20 224±6 395 3.35±0.77雌二醇組E2 group 17 569±5 856 5.65±0.78**BPA低劑量20 μg/kg BPA 23 004±7 668 4.85±0.77**BPA中劑量60 μg/kg BPA 4 091±1 446**2.63±0.77 BPA高劑量180 μg/kg BPA 735±245**1.97±0.48**

        2.5 BPA對ICR小鼠子宮雌、孕激素受體(ER、PR)表達的影響

        免疫組化結(jié)果顯示,給予BPA后,ICR小鼠子宮ER表達有一定程度增加,但隨劑量增加下降。PR表達較對照組增加明顯,以低劑量組最為明顯。見表4,圖3、4(見彩插10)。

        表4 BPA對ICR小鼠子宮雌、孕激素受體(ER、PR)表達的影響((x±s,n=6)Tab.4 Effects of BPA on the expression of ER and PR in the ovariectomized ICR m ice(x±s,n=6)

        3 討論

        良性前列腺增生癥(BPH)是一種多發(fā)于中老年男性的常見疾病,并隨著年齡增大發(fā)病率升高。BPH病因復(fù)雜,其中雌激素介入BPH的發(fā)病過程,而且低劑量的雌激素能夠促進BPH發(fā)生[8,9]。BPA作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,經(jīng)體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化后,其雌激素活性增高[10]。由于BPA雌激素活性的存在,無法排除其與BPH存在一定聯(lián)系。

        本次研究中,去勢ICR小鼠灌胃給予20 μg/ (kg·d)BPA一周,7/10的動物處于動情期和動情后期,動物平均體重高于對照組,并且動物子宮平均重量和含水量增加,子宮臟器系數(shù)增大。鏡下觀察結(jié)果顯示,低劑量BPA組動物子宮腔面積增大,子宮上皮增生明顯。但隨著BPA劑量的逐步增大,其增生作用逐漸減弱。研究表明20 μg/(kg·d)的BPA在生物體內(nèi)具有雌激素活性,并且在三個實驗劑量組中,雌激素活性最強。根據(jù)免疫組化結(jié)果,20 μg/(kg·d)BPA組動物子宮ER和PR受體表達增高,當(dāng)BPA劑量增大至9倍后,小鼠子宮組織ER的表達低于對照組。

        BPA能夠與ER受體結(jié)合,進而誘導(dǎo)激活雌激素反應(yīng)相關(guān)基因,產(chǎn)生雌激素活性[11]。小鼠暴露于20 μg/(kg·d)BPA(低于人類孕婦的暴露水平),其雌激素活性的增強可能通過誘導(dǎo)ER和PR表達增加而達到。由于BPA能夠與雄激素亞型受體結(jié)合[12],隨著BPA劑量增加,雄激素活性的表達增強,在一定程度上可能削弱雌激素對子宮的增生作用,從而導(dǎo)致子宮隨BPA劑量增加而呈萎縮趨勢。至于其具體通過何種機制導(dǎo)致雌激素活性隨BPA劑量增加而降低,需要進一步探討。

        (本文圖2見彩插9,圖3、4見彩插10)。

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        Proliferative Effect of Intragastrically Adm inistered Low Dose Bisphenol A on the Uterus in Ovariectom ized M ice

        WU Jian-h(huán)ui1,2,YANG Rong-fu2,XU Yin-wen2,WANG Jiu-jiu2,LIU Xiang-yun2,LIU Gui-m ing2,HE Gui-lin2,SUN Zu-yue2
        (1.Fudan university,Shanghai 200433,China. 2.Department of Pharmacology and Toxicology of Shanghai Institute of Planned Parenthood Research. National Evaluation Center for the Toxicology of Fertility Regulation Drugs,Shanghai 200032)

        ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of low dose bisphenol A(BPA),a xenoestrogen,given by gastric lavage,on uterus of female mice.M ethods Ovariectomized female ICR mice were bred for one week observation and excluding unqualified animals.50 mice were random ly divided into 5 groups,10 animals per group.The m ice were administered 10.0 μg/(kg.d)17β-estradiol(E2)by subcutaneous injection and 0,20.0,60.0 or 180.0 μg/ (kg.d)BPA via intragastric gavage for 7 days.The body weight was monitored every 3 days,vaginal smears were examined by cytology,and the animals were killed at 24 hours after the last treatment.The uterus was removed to measure the wet weight,water content,and to calculate the organ coefficient.The height of endometrial epithelial cells and luminalarea were analyzed with a micro-image analysis system(M IVNT).The expression of estrogen receptor(ER)and progesterone receptor(PR)of uterus were analyzed by immunohistochemistry.Results①Compared with the control,the mean animal body weights of mice of the E2group and low dose BPA group were increased,while there were no significiant differences between mid and high dose BPA groups and control.②Based on cytological data of vaginal smear,animal number in estrus were:0/10 in control group,10/10 in E2 group,2/10 in low-dose BPA group,1/10 in mid-dose BPA group,and 0/10 in high-dose BPA group.③Compared with the control group,the uterus weight,water content and organ coefficient in the low-dose BPA group were increased,while those of mid-and high-dose BPA groups were significantly decreased(P<0.05).④According to the data of histopathology and MIVNT,compared with the control,the uterine luminal area in the low-dose BPA group was significantly enlarged,and the height of endometrial epithelial cells was increased(P<0.01),while in the mid-and high-dose BPA groups,the luminal area was decreased(P<0.01),and the height of endometrial epithelial cells was decreased(P<0.01).⑤The immunohistochemical data showed that compared with the control group,the ER and PR expressions in the low-dose BPA group were increased,while in the m id-and highdose BPA groups,the expression of ER was decreased,but there were no significant differences.ConlusionA per os intake of BPA at a dose of 20 μg/(kg.d),a dosage below human daily intake,may promote uterine proliferation in female m ice.But this estrogenic activity is decreasing alone with an increasing dose of BPA.

        Bisphenol A(BPA),Estrogenic activity,Uterus,Mice,female

        R994.6

        A

        1005-4847(2010)02-0145-04

        2009-08-05

        上海市科委“創(chuàng)新行動計劃”實驗動物研究項目(編號:09140900500)。

        吳建輝(1976-),男,助理研究員,博士研究生,研究方向:男性生殖健康及前列腺疾病治療藥物藥理毒理學(xué)研究。Tel:021-64438949,E-mail:wwjh_731@yahoo.com.cn。

        孫祖越,E-mail:sunzy64@163.com.

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