陳永杰，卜淑敏，沈紅

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)系，北京 102206;2.首都體育學(xué)院，北京 100080)

研究報告

17β－雌二醇對去卵巢大鼠子宮β－連環(huán)素和E－鈣粘素蛋白表達的影響

陳永杰1，卜淑敏2，沈紅1

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)系，北京 102206;2.首都體育學(xué)院，北京 100080)

目的旨在研究17β－雌二醇對去卵巢大鼠子宮β－連環(huán)素(β－catenin)和E－鈣粘素(E－cadherin)蛋白表達的影響。方法將30只健康3月齡雌性SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組、去卵巢組、去卵巢和雌激素給藥組。大鼠去卵巢1周后，給藥組大鼠頸部皮下注射17β－雌二醇，每周3次，每次50 μg/(kg·bw)，連續(xù)給藥10周。采用放免法、免疫組化法和Western blot方法分別檢測大鼠血清E2水平、子宮β－catenin和E－cadherin蛋白的免疫定位和表達。結(jié)果大鼠去卵巢后子宮指數(shù)和血清E2水平顯著下降，但大鼠補充外源性17β－雌二醇后，上述兩項指標(biāo)均顯著回升且與假手術(shù)組相比無顯著差異。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組和去卵巢組大鼠子宮內(nèi)膜的細胞膜上有β－catenin和E－cadherin蛋白表達，而雌激素給藥組大鼠子宮內(nèi)膜細胞膜和細胞核上都有E－cadherin表達。Western blotting結(jié)果進一步顯示，去卵巢組大鼠子宮β－catenin和E－cadherin蛋白表達量極顯著低于假手術(shù)組和雌激素給藥組。結(jié)論17β－雌二醇不僅能使E－cadherin蛋白在去卵巢大鼠子宮細胞中的免疫定位發(fā)生變化，而且還能刺激βcatenin和E－cadherin蛋白的表達。

雌二醇;去卵巢大鼠;β－連環(huán)素;E－鈣粘素

女性在絕經(jīng)期由于卵巢功能衰退易出現(xiàn)肥胖、脂肪肝、冠心病、高血壓、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥等疾病，稱為絕經(jīng)期綜合征。絕經(jīng)期綜合征是困擾當(dāng)今社會的一大醫(yī)學(xué)問題，目前臨床上常用雌激素替代療法(HRT)，即通過直接補充雌激素(estrogen，E2)來治療此病癥。該法雖然療效確切，但如果長期服用，會出現(xiàn)較大的副作用，如增加陰道出血和促進生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)生等［1］，無法在臨床上廣泛應(yīng)用和推廣。E2對子宮內(nèi)膜增殖作用及致腫瘤作用的確切機制目前還不清楚，揭示E2介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生途徑，有助于從根本上解決E2的潛在致癌作用。E－鈣粘素(E－cadherin)是一種Ca2+依賴性細胞粘附分子，廣泛分布于上皮細胞，是維持上皮細胞極性及細胞間粘附、連接的主要分子。β－連環(huán)素(β－catenin)是細胞骨架蛋白和Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之一，在細胞連接處它與E－cadherin結(jié)合形成E－cad－cat復(fù)合體相互作用，參與細胞粘附，維持上皮細胞的正常形態(tài)，而游離的β－catenin可進入細胞核，調(diào)節(jié)基因表達［2，3］。許多研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中常常伴有異常Wnt信號的激活，E－cadherin表達異常常與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)［4］。為此，本實驗采用國內(nèi)外通用的模擬絕經(jīng)后綜合征的去卵巢大鼠模型［5］，檢測了補充外源性17β－雌二醇對去卵巢大鼠子宮β－catenin和E－cadherin蛋白表達的影響，旨在為探討絕經(jīng)后婦女長期服用E2繼發(fā)子宮內(nèi)膜癌的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

17 β－estradiol(E2，Sigma E 2758－5G)，多聚甲醛(Merck，德國)，石蠟(上海華永石蠟有限公司)，兔源β－catenin多克隆抗體(RB－1491－P0 NeoMarkers Biotechnology，F(xiàn)remont，)、兔源E－cadherin多克隆抗體(H－108，SC－7870)，生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗、辣根酶標(biāo)記卵磷蛋白素、山羊抗兔IgG/堿磷酶標(biāo)記抗體(ZB－2308中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、rabbit－anti－actin(SC－1616R中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色試劑盒和堿磷酶底物BCIP/NBT顯色濃縮液(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，橄欖油(PONS)，E2試劑盒(中國原子能科學(xué)研究院)， RIPA蛋白裂解液(P0013B碧云天)，SDS－PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)(P0015碧云天)。Leica切片機(Leica，德國)，顯微鏡(Olympus BX51)，電泳儀(DYY－7C型北京六一儀器廠)。

1.2 實驗動物分組和處理

三月齡未經(jīng)產(chǎn)Sprague Daw ley雌性大鼠30只，體重(230±15)g，購自并飼養(yǎng)在維通利華實驗動物有限公司［SCXK(京)2006－0008］。大鼠在通風(fēng)無菌環(huán)境下自由采食與飲水，飼養(yǎng)7d后，按體重隨機分為假手術(shù)組(Sham)、去卵巢組(OVX)和E2給藥組(OVX+E2)，每組10只動物。去卵巢和E2給藥兩組大鼠均摘除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組僅切除卵巢附近少許脂肪。無菌手術(shù)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部進行［SYXK(京)2006－0025］，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。手術(shù)1周后，E2組大鼠每周按體重頸部皮下注射3次17 β－雌二醇，每次50 μg/(kg·bw)，連續(xù)注射10周。每周稱一次體重，按體重調(diào)整給藥劑量，假手術(shù)和去卵巢組大鼠同時給予相同體積的溶劑(無水乙醇和橄欖油)。

1.3 取材

實驗結(jié)束時，大鼠禁食12 h，按體重腹腔注射水合氯醛(0.1 m l/kg)麻醉，腹主動脈取血后處死，剪開腹腔，游離子宮，仔細剪去子宮周圍脂肪組織，稱重，計為子宮濕重，子宮指數(shù)=子宮濕重(mg)/體重(g)。迅速將左側(cè)子宮投入4%多聚甲醛溶液中固定，將右側(cè)子宮液氮凍存以備蛋白提取。

1.4 血清E2含量的測定

常規(guī)方法制備血清后，－40℃保存。用放射免疫法測定大鼠血清E2含量，實驗操作按照試劑盒說明書進行。

1.5 免疫組織化學(xué)分析

子宮石蠟連續(xù)切片(5 μm)經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水、抗原修復(fù)、3%雙氧水處理后，用山羊血清封閉1 h，加一抗(β－catenin，E－cadherin)，4℃過夜;PBS洗3次，每次5 min;加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG室溫孵育2 h，PBS洗3次，每次5 m in，加辣根酶標(biāo)記卵磷蛋白素室溫孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min，DAB顯色。切片經(jīng)蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后，Olympus顯微鏡下觀察拍照。

1.6 W estern b lotting測定分析

取200 mg子宮組織在液氮中研成粉末，加入1 m L組織裂解液，研磨后靜置于冰上2 h，4℃12 000 r/m in離心30 m in，取上清，留一部分檢測蛋白質(zhì)濃度，其余蛋白樣品與SDS－PAGE蛋白上樣緩沖液混勻，沸水煮5 m in，分裝后－40℃保存。

取蛋白樣品40 μg，上樣，以80 V電壓，在10%的SDS－PAGE中分離約2 h后，以80 V電壓2 h，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PVDF膜用一抗(β－catenin，E－cadherin，β－actin)孵育4℃過夜，次日，室溫作用2 h，加二抗(山羊抗兔Ig/ G堿磷酶標(biāo)記)室溫孵育2 h，堿磷酶底物BCIP/ NBT顯色濃縮液作用PVDF膜顯色直至條帶出現(xiàn)，放入水中終止顯色，掃描各條帶灰度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，實驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異顯著性采用方差分析的LSD(ONE WAY－ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠子宮重量及子宮指數(shù)的分析

各組大鼠子宮濕重和子宮指數(shù)統(tǒng)計分析結(jié)果見圖1。由圖1可知，去卵巢組大鼠子宮濕重和子宮指數(shù)極顯著低于假手術(shù)組和E2組(P＜0.01)，E2組大鼠子宮濕重顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05)，但兩組大鼠子宮指數(shù)差異無顯著性。

圖1 各組大鼠子宮濕重和子宮指數(shù)的分析Fig.1 Analysis of the uterus wet weight and uterus index of the rats in different groups

2.2 大鼠血清E2含量的分析

3組大鼠血清E2測量結(jié)果見圖2，與假手術(shù)組相比，去卵巢大鼠血清E2含量極顯著下降(P＜0.01)，E2給藥10周后，E2組大鼠血清E2含量極顯著升高(P＜0.01)，與假手術(shù)組相比沒有顯著性差異。

2.3 大鼠子宮β-catenin蛋白的表達

采用免疫組化法檢測β－catenin蛋白在大鼠子宮中的表達，結(jié)果見圖3(彩插5)。由圖3可見，各組大鼠子宮內(nèi)膜腔上皮、腺上皮、間質(zhì)以及肌層中均有棕色β－catenin陽性表達產(chǎn)物，其中假手術(shù)組和去卵巢組大鼠子宮內(nèi)膜細胞膜棕色明顯，細胞核呈藍色，沒有β－catenin蛋白表達;而E2組大鼠子宮內(nèi)膜細胞膜和細胞質(zhì)棕色均增強，細胞核藍色變淺并稍有棕色，說明β－catenin蛋白在細胞核也有表達(圖3h和i)。

Western blotting結(jié)果進一步顯示(圖4)，去卵巢組大鼠子宮β－catenin蛋白表達量比假手術(shù)組極明顯降低(P＜0.01)，而E2組大鼠子宮β－catenin表達量比去卵巢組極顯著增加(P＜0.01)，且與假手術(shù)組沒有顯著差異。

圖2 各組大鼠血清E2含量的分析(**P＜0.01)Fig.2 Analysis of serum E2concentration of the rats in different groups

2.4 大鼠子宮E-cadherin蛋白的表達

圖4 大鼠子宮β－catenin和內(nèi)參β－actin的免疫印跡結(jié)果(A)和蛋白的相對表達水平(B)(**P＜0.01)Fig.4 The results of Western blotting of β－catenin and β－actin protein(A)and the relative expression levels of β－catenin(B)and β－catenin protein(B)in the rat uterine tissue

E－cadherin蛋白在大鼠子宮的免疫定位結(jié)果如圖5(彩插5)所示。由圖5可見，棕色為陽性表達產(chǎn)物，假手術(shù)組中，E－cadherin蛋白主要在子宮內(nèi)膜腺上皮和腔上皮的細胞膜上表達，細胞核中不表達，基質(zhì)細胞中只有背景水平的表達。E2組中，E－cadherin在基質(zhì)和肌層中的表達增強，且定位發(fā)生變化，不僅細胞膜表達，細胞核也有表達(圖5h和i)。

Western blotting結(jié)果進一步顯示(如圖6所示)，去卵巢組大鼠子宮E－cadherin蛋白表達量極顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01)，而E2組大鼠子宮E－cadherin蛋白表達量比去卵巢組明顯升高(P＜0.01)，與假手術(shù)組沒有顯著差異。

圖6 大鼠子宮E－cadherin和內(nèi)參β－actin的免疫印跡結(jié)果(A)和E－cadherin蛋白的相對表達水平(B) (**P＜0.01)Fig.6 The results of Western blotting of E－cadherin and β－actin proteins(A)and relative expression level of E－cadherin(B)in the rat uterine tissue.

3 討論

E2被廣泛用于防治絕經(jīng)期綜合征，但長期持續(xù)E2作用可增加患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險。去卵巢動物模型是一種能夠較好地模擬人類因E2不足而導(dǎo)致絕經(jīng)期綜合征發(fā)生的動物模型。本實驗中，大鼠去卵巢后血清E2水平和子宮指數(shù)均顯著下降，補充外源性E2后，血清E2水平和子宮指數(shù)明顯回升且接近假手術(shù)組，提示本實驗補充的外源性E2接近大鼠的生理劑量，能使子宮指數(shù)幾乎恢復(fù)至正常水平。推測本實驗采用的E2注射劑量應(yīng)該不會導(dǎo)致去卵巢大鼠子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。

β－catenin有雙重作用，一方面作為Wnt/βcatenin信號通路的關(guān)鍵分子，游離在細胞質(zhì)，當(dāng)有Wnt信號時，β－catenin不能被降解復(fù)合物(APCGSK3β－Axin)及時降解，使胞質(zhì)游離β－catenin水平升高，并轉(zhuǎn)運到細胞核里與Tcf結(jié)合時，調(diào)節(jié)靶癌基因c－myc過度表達，導(dǎo)致細胞癌變［6］。另一方面，βcatenin在細胞膜上能與E－cadherin結(jié)合形成E－cadcat復(fù)合體，發(fā)揮細胞粘附作用，當(dāng)E－cadherin突變時，可能使細胞質(zhì)中游離的β－catenin水平升高，激活靶基因(如致癌基因等)［7］。

Hou等［8］研究認為Wnt/β－catenin信號通路在E2介導(dǎo)的子宮生長中起關(guān)鍵作用，是E2發(fā)揮ER非依賴性效應(yīng)的主要作用途徑，E2通過上調(diào)Wnt信號通路中Wnt4，Wnt5a和Fz2幾個分子的表達，啟動Wnt/β－catenin信號通路，使β－catenin迅速聚積到核里，啟動下游基因表達。謝偉等［9］在體外觀察了E2對子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞βcatenin表達的影響，發(fā)現(xiàn)E2能劑量和時間依賴性地促進子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞β－catenin mRNA和蛋白的表達。本實驗中，E2能夠使去卵巢大鼠子宮部分β－catenin蛋白內(nèi)聚到腔上皮和腺上皮細胞的細胞質(zhì)和細胞核中，提示β－catenin可能參與E2調(diào)節(jié)子宮腔上皮和腺上皮增殖的過程，此結(jié)果與Hou等的結(jié)果相符。Western bolt結(jié)果進一步顯示去卵巢后β－catenin蛋白表達顯著降低，給予雌激素治療后，與去卵巢組相比β－catenin蛋白表達顯著升高，表明E2能上調(diào)去卵巢大鼠子宮β－catenin蛋白的表達。說明能E2可能是通過激活Wnt/β－catenin信號通路而持續(xù)刺激子宮內(nèi)膜的增殖。

E－cadherin是表達于所有正常上皮組織細胞膜上的一種代表性鈣粘附素分子，屬于鈣依賴性跨膜糖蛋白，主要介導(dǎo)細胞間同質(zhì)粘附，維持上皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性和極性。近年來在腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞必須首先從鄰近的腫瘤細胞中分離，再侵入周圍組織，因此，細胞間粘附的喪失是腫瘤侵襲、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一［10］。E－cadherin的功能障礙或缺失會使腫瘤細胞間的連接減弱，瘤細胞易于從母體脫離，發(fā)生轉(zhuǎn)移;研究發(fā)現(xiàn)E－cadherin的表達程度與多種惡性腫瘤的腫瘤臨床分級呈負相關(guān)，E－cadherin表達下調(diào)或缺失預(yù)示腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良［11］。本實驗結(jié)果表明E2能使E－cadherin在子宮內(nèi)膜的表達出現(xiàn)定位變化，由細胞膜轉(zhuǎn)移至細胞核，說明補充E2使E－cadherin失去正常膜定位，導(dǎo)致細胞粘附功能降低或消失。Western blotting結(jié)果進一步顯示，去卵巢大鼠子宮E－cadherin蛋白表達顯著降低，但補充E2后E－cadherin蛋白表達顯著升高，提示E2能上調(diào)去卵巢大鼠子宮E－cadherin蛋白的表達。

正常情況下β－catenin與E－cadherin的結(jié)合會增加其在細胞質(zhì)中的穩(wěn)定性而避免被水解，同時也使β－catenin呈現(xiàn)穩(wěn)定的膜表達，當(dāng)E－cadherin表達下降或缺失時，β－catenin便會在胞質(zhì)內(nèi)積累，Wnt信號通路激活的閾值隨之下調(diào);反之E－cadherin在細胞膜上的穩(wěn)定在一定程度上也依賴于與β－catenin的結(jié)合［12］，β－catenin與E－cadherin兩者相互影響，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。長期持續(xù)無孕激素拮抗的高E2作用可能激活Wnt信號通路，使細胞膜上的β－catenin進入細胞核內(nèi)，激活靶基因轉(zhuǎn)錄，使子宮不斷的處于增殖中，同時引起E－cadherin的表達異常，導(dǎo)致細胞粘附功能降低或消失，有可能進一步引起腫瘤的發(fā)生。

17β－雌二醇不僅能使E－cadherin蛋白在去卵巢大鼠子宮細胞中的免疫定位發(fā)生變化，而且還能刺激β－catenin和E－cadherin蛋白的表達。

(本文圖3，5見彩插5。)

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Effects of 17β-Estradiol on the Exp ression of β-Catenin and E-Cadherin Proteins in the Uterus of Ovariectom ized Rats

CHEN Yong－jie1，BO Shu－m in2，SHEN Hong1
(1.Department of Animal Science and Technology;Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China; 2.Capital Institute of Physical Education，Beijing 100080，China)

ObjectiveTo study the effects of 17β－estradiol on the protein expression of β－catenin and E－cadherin in the uterus of ovariectomized rats.M ethods Three－month－old female Sprague－Dawley rats were random ly divided into three groups:sham－operation group，ovariectom ized group and estradiol group.17β－estradiol was injected subcutaneously three times a week at a concentration of 50 μg/kg for 10 weeks.The serum estradiol levels were determ ined by RIA，and the immunolocalization and content of β－catenin and E－cadherin proteins were detected by immunohistochemistry and Western blotting，respectively.ResultsThe uterus weight index and serum E2level were decreased in ovariectomized rats，and the decrease could be reversed by injection of estradiol.As a result，there was no significant difference between the sham－operation group and estradiol group.In the sham and ovariectomized groups，the positive immunoreactivity of βcatenin and E－cadherin proteins were present only in endometrial cell membrane.However，the positive immunoreactivity of E－cadherin protein was not only present in the cell membrane，but also was in cell nuclei in the estradiol group.The results of Western blotting further indicated that the content of β－catenin and E－cadherin proteins were significantly decreased in ovariectomized group compared with the sham－operation group and estradiol group.ConlusionThese results indicate that 17β－estradiol not only regulates the immunolocalization of E－cadherin protein in the uterus in ovariectomized rats，but alsostimulates the expression of β－catenin and E－cadherin proteins.

Estradiol;Ovariectomized rats;β－catenin;E－cadherin

R271.116

A

1005－4847(2010)02－0122－05

2009－08－19

國家自然科學(xué)基金資助(編號:30771046);北京市教委資助項目(KM200770029001，KM200910020006)。

陳永杰(1983－)，男，碩士研究生，研究方向:獸醫(yī)藥理學(xué)E－mail:chenyongjie83@163.com

沈紅，副教授，E－mail:shenhong912@sina.com