白慧稱,李 軍,劉敬浩,田永路,朱德生

(北京大學(xué)實驗動物中心,北京 100871)

研究報告

高脂膳食對小鼠生化及病理形態(tài)的影響

白慧稱,李 軍,劉敬浩,田永路,朱德生

(北京大學(xué)實驗動物中心,北京 100871)

目的高脂膳食對機體血液、組織勻漿中各種生化指標(biāo)的影響,尤其是對膽固醇等脂質(zhì)代謝的影響,為研究高膽固醇引起的心血管等疾病建立模型。方法將 C57BL/6j小鼠 63只隨機分為 2組。普食組(用普通飼料飼喂)12只,雌雄各 6只,高脂組 (用高脂飼料飼喂)51只,雌 26只、雄 25只。單籠飼喂,飼喂期為 67 d。觀察動物體重、攝食量、比較血液以及肝、腎組織勻漿中有關(guān)脂類代謝和抗氧化方面的生化指標(biāo)以及組織病理學(xué)觀察。結(jié)果高脂組血液中膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)均顯著高于普食組 (P<0.05);高脂組肝、腎臟組織勻漿中 T-AOC、CuZn-SOD、SOD、AKP、NOS、MDA的水平與普食組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異;與普食組相比,雄性小鼠攝食量差異顯著(P<0.05)、體重差異不顯著;病理觀察可見高脂組中肝細(xì)胞空泡變性。結(jié)論通過高脂膳食成功的建立了高膽固醇血癥模型,該模型有可能在膽固醇濃度升高引起的脂質(zhì)代謝異常、動脈粥樣硬化、冠心病和其他代謝性疾病的研究中發(fā)揮作用。

高脂膳食;膽固醇;血液生化;組織勻漿

隨著飲食中的膽固醇含量不斷增加,人患心臟病和中風(fēng)的幾率越來越高。亞太心血管疾病和中風(fēng)調(diào)查顯示,亞洲人體內(nèi)的膽固醇每增加一單位 (1 mmol/L),心血管疾病死亡危險幾率就增加35%,和血管有關(guān)的中風(fēng)幾率也會增加 25%。我國大約有心血管疾病患者 1300多萬,并且每年以 10%的發(fā)病率增長,我國心血管疾病的發(fā)病率:高血壓為18.8%、冠心病為 10%、先心病為 3%、風(fēng)心病為1%、急性心肌梗死為 15.4/10萬,流行病學(xué)調(diào)查顯示,心血管疾病的發(fā)病率急劇上升,并呈年輕化趨勢[1]。心血管疾病的發(fā)病因素復(fù)雜,和基因、飲食、環(huán)境以及社會因素均有一定的關(guān)系,尤其是飲食因素,高脂肪膳食導(dǎo)致了一系列的改變,比如導(dǎo)致血中膽固醇升高,從而產(chǎn)生多種不易被人察覺的、緩慢進(jìn)行性的危害,可以說,高膽固醇血癥是一種潛伏的健康“殺手”。脂質(zhì)代謝紊亂特別是血漿膽固醇濃度升高可導(dǎo)致并加速動脈粥樣硬化的進(jìn)展,使冠心病和血栓形成性疾病容易發(fā)生。血漿 TC水平增高,冠心病危險性增高;LDLC水平也與冠心病發(fā)病率呈正相關(guān)[2,3]。有研究表明,膽固醇和阿爾茨海默病 (AD)之間存在著重要的聯(lián)系[4,5]。如果在動物上復(fù)制出人類高脂膳食類似的改變,對研究高脂膳食的致病機理,控制高脂膳食導(dǎo)致的病理變化將非常有幫助[6]。

本實驗中用高脂膳食飼喂小鼠,觀察生化、形態(tài)學(xué)改變,希望在動物體內(nèi)觀察到人類高脂膳食類似的改變,為研究高脂飲食相關(guān)疾病,如動脈粥樣硬化、心血管病以及代謝性疾病提供合適的動物模型。

1 材料和方法

1.1 試劑

試劑:超氧化物岐化酶 (SOD)測試盒 (包含SOD和銅鋅超氧化物岐化酶 CuZn-SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)測試盒、一氧化氮合酶(NOS)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒 (南京建成),低密度脂蛋白膽固醇試劑盒 LDLC、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒 HDLC、甘油三酯試劑盒-TG(北京北化康泰臨床試劑有限公司),總膽固醇 (TC)試劑盒 (上海申索佑福醫(yī)學(xué)診斷用品有限公司)均為商業(yè)化的產(chǎn)品。

1.2 動物的選擇

供試動物 C57BL/6J小鼠 63只、雌雄各半,4周齡,小鼠體重:雌性 (13.18±1.08)g;雄性 (14.76± 1.12)g;SPF級,來源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心[SCXK-(軍)2007-004]。

1.3 飼料

普通飼料配方:每 100 g飼料中能量的比值:糖50.04%、蛋白質(zhì) 14.70%、脂肪能 35.26%,其他成分的含量:磷酸氫鈣 1%、碳酸鈣 1.3%、賴氨酸0.12%、蛋氨酸 0.3%、氯化膽堿 0.1%、礦物元素添加劑 0.04%、食鹽 0.2%、維生素添加劑 0.02%。

高脂飼料配方:每 100 g飼料中能量的比值:糖35.15%、蛋白質(zhì) 14.42%、脂肪能 50.43%,其他成分的含量:磷酸氫鈣 1%、碳酸鈣 1.1%、賴氨酸0.12%、蛋氨酸 0.3%、氯化膽堿 0.1%、礦物元素添加劑 0.04%、食鹽 0.2%、維生素添加劑 0.02%。

上述飼料由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心加工制作,塑料袋密封包裝,于 4℃冰箱保存。

1.4 動物飼養(yǎng)

動物飼養(yǎng)于北京大學(xué) SPF級動物房,12 h明暗交替,單籠飼養(yǎng),自由采食。

1.5 動物及其處置

將C57BL/6J小鼠63只隨機分為2組。普食組12只,雌雄各 6只,高脂組 51只,雌26只、雄 25只。分別飼喂普通飼料和高脂飼料,飼喂期為 67 d。試驗過程中觀察并記錄每組 C57BL/6J小鼠的攝食量和體重。飼喂結(jié)束后,小鼠禁食 12 h、正常飲水,采用眼靜脈叢采血并處死動物,制備血清;將肝臟和腎臟加入預(yù)冷的 0.1 mol/L的硼酸緩沖液(pH 8.3)研磨 (臟器∶緩沖液 =1∶5),制備組織勻漿,4℃10000 r/min離心 20 min,取上清,-20℃保存?zhèn)錅y。

1.6 測定指標(biāo)

1.6.1 一般觀察:對各組小鼠的體重、攝食量進(jìn)行動態(tài)檢測,每周測定 1次。

1.6.2 血液生化指標(biāo):試驗結(jié)束后禁食 12 h,在眼底靜脈叢采血,測定血清 SOD、MDA、NOS、TC、HDL-C、LDL-C、TG濃度。

1.6.3 肝臟、腎臟組織勻漿指標(biāo):測定 T-AOC、CuZn-SOD、SOD、AKP、NOS、MDA含量。

1.6.4 病理檢查:取肝、腎、胸主動脈、大腦、心臟,經(jīng) 10%的福爾馬林溶液固定,做常規(guī)脫水、包埋,進(jìn)行 HE染色,普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.6.5 數(shù)據(jù)分析:利用 SPSS15.0軟件進(jìn)行組間差異的比較,采用的是獨立樣本的 t檢驗(Independent-SampletTest)結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

高脂組與普食組中雌雄性小鼠的體重均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),(圖 1)。

每周中平均每天攝食量中高脂組與普食組相比雄性小鼠在 2～ 4周 (P <0.05)、6周 (P < 0.01)、7～8周(P<0.05)差異均顯著,部分結(jié)果見表 1和圖 2。

圖1 體重生長曲線Fig.1 The growth curve ofweight in male and female animals of different groups

圖 2 攝食量的變化Fig.2 Changes of food intake in male and female animals of different groups

表 1 攝食量的變化Tab.1 Change of food intake

2.2 血液生化指標(biāo)

高脂組與普食組相比血清中 TC和LDLC的水平有顯著性差異 (P<0.05),而 HDLC、SOD、MDA、NOS、TG均無統(tǒng)計學(xué)差異。部分結(jié)果見表 2。

2.3 肝臟組織勻漿指標(biāo)

高脂組與普食組相比肝臟組織勻漿中 T-AOC、 CuZn-SOD、SOD、AKP、NOS、MDA均無統(tǒng)計學(xué)差異(表 3)。

2.4 腎臟組織勻漿指標(biāo)

高脂組與普食組小鼠相比腎臟組織勻漿中 TAOC、CuZn-SOD、SOD、AKP、NOS、MDA無統(tǒng)計學(xué)差異。部分結(jié)果見表 4。

表2 組間動物血清 TC、TG、HDLC、LDLC、SOD、NOS、MDA比較Tab.2 Comparison of serum TC,TG,HDLC,LDLC,SOD,NOS,MDA level between standard chow diet group and high-fat diet group

表3 組間動物肝臟組織勻漿中 T-AOC、MDA、CuZn-SOD、NOS、AKP、SOD比較Tab.3 Comparison of T-AOC,MDA,CuZn-SOD,NOS,AKP,SOD level in Homogenized liver tissue be tween standard chow diet group and high-fat diet group

表4 組間動物腎臟組織勻漿中 T-AOC、MDA、CuZn-SOD、NOS、AKP、SOD比較Tab.4 T-AOC,MDA,CuZn-SOD,NOS,AKP,SOD level in homogenized kidney tissue of standard chow dietmice and high-fat dietmice

2.5 病理檢查

病理學(xué)檢查,僅在肝臟組織觀察到形態(tài)學(xué)改變,其余臟器未觀察到明顯的異常改變。高脂組肝臟在實質(zhì)內(nèi)可見肝細(xì)胞內(nèi)大泡性空泡變性 (圖 3見彩插 3)。

3 討論

每周中平均每天攝食量中高脂組與普食組相比雄性小鼠在 2～ 4周 (P <0.05)、6周 (P < 0.01)、7～8周(P<0.05)均出現(xiàn)顯著性差異;高脂組攝食量明顯低于對照組。我們推測,可能是高脂膳食的適口性差[7];高脂組與普食組中雌、雄性的小鼠體重均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),這可能是由于高脂飼料提供了更多的能量 (每 100 g普通飼料的總能量 209.17 KJ,每 100 g高脂飼料的總能量222.29 KJ)。

血液生化指標(biāo)中,高脂組與普食組相比血清中TC和LDLC的水平有顯著性差異,而 HDLC、SOD、MDA、NOS、TG均無統(tǒng)計學(xué)差異。肝、腎臟組織勻漿指標(biāo)中,高脂組與普食組相比肝、腎臟組織勻漿中T-AOC、CuZn-SOD、SOD、AKP、NOS、MDA均無統(tǒng)計學(xué)差異,這些指標(biāo)未檢測出統(tǒng)計學(xué)差異,高脂組小鼠肝臟中可見脂肪空泡,提示高脂飲食導(dǎo)致了肝內(nèi)脂質(zhì)代謝異常。

曹亞軍等[8]也利用高脂膳食誘導(dǎo)大鼠高脂,其結(jié)果顯示,高脂模型組的血清 TC、TG、LDLC、MDA明顯升高,與之相比本實驗只檢測出 TC、LDLC明顯升高,并未檢測出 TG和MDA明顯升高。導(dǎo)致本實驗和上述實驗差異的原因有:1)兩實驗中高脂飼料中各種物質(zhì)成分的差異;2)大、小鼠對高脂食物敏感性差異。

動物的衰老是一種緩慢的退行性變化,這是因為動物體內(nèi)有多種抗氧化物和酶,能直接清除活性氧等有害物質(zhì),修復(fù)、降解細(xì)胞內(nèi)受損的脂類、蛋白質(zhì)、核酸等生物分子的大部分破損成分,能將未破損的成分區(qū)分和儲存起來,以便重復(fù)利用。正是由于動物體內(nèi)存在這種高效的損傷代謝防御系統(tǒng),機體能夠成功地克服生理和病理的變化或損傷[9]。本研究中高脂組肝臟、腎臟中未檢測出MDA的有明顯升高,此現(xiàn)象可能與動物體內(nèi)高效的損傷代謝防御系統(tǒng)作用有關(guān),機體能夠成功地克服這種損傷性改變,處于代償期,因而肝臟、腎臟中MDA水平可以保持相對穩(wěn)定。

實驗中高脂組血清中MDA雖未有明顯升高差異,但可以看出有升高的趨勢,MDA的代謝途徑是由血液流向肝臟,再由肝臟流向機體其他組織 (包括腦組織)。肝臟的解毒功能是有限的,當(dāng)血液中大量的MDA達(dá)到肝臟不能完全清除的時候,長期的過量的MDA引起疾病、亞健康以至機體老化,產(chǎn)生不良的生物學(xué)影響[10]。

血清膽固醇含量和心血管疾病關(guān)系已經(jīng)得到公認(rèn)。和許多慢性老年性疾病的關(guān)系也非常密切。阿爾茨海默病的一個共同特點是β-淀粉樣蛋白在特定腦區(qū)域的不正常的聚集。研究顯示,血液中膽固醇總量及神經(jīng)元內(nèi)膽固醇的分布均能影響β-淀粉樣蛋白的生物合成,升高的膽固醇水平可以增加細(xì)胞內(nèi)和大多數(shù)阿爾茨海默病動物模型中β-淀粉樣蛋白的含量,而抑制膽固醇合成的藥物可降低這些模型中β-淀粉樣蛋白的含量[11]。

目前,利用高脂飼料的動物模型,進(jìn)行了許多抗血脂藥物的藥效學(xué)評價,例如山楂所含的黃酮能抑制3羥基 3甲基戊二酰輔酶 A(HMGCoA)還原酶的活性,從而抑制內(nèi)源性膽固醇的合成,并能升高HDLC,降低 LDLC水平[12]?？喽棺由飰A能顯著降低血漿 TC,升高 HDLC水平,降低血液黏度[13];復(fù)方苦豆子顆粒能明顯降低血清及肝臟 MDA的含量[8]。

本實驗中高脂組成功的誘導(dǎo)了 TC、LDLC含量明顯升高,建立了高膽固醇血癥模型,對研究高脂血癥相關(guān)的老年性疾病、心血管疾病以及對降脂類藥物的研究和開發(fā)具有重要作用 。

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Effect of High FatD iet on M ice:Chem ical andM orphological Studies

BA IHui-chen,L IJun,L IU Jing-hao,T IAN Yong-lu,ZHU De-sheng
(LaboratoryAnimal Center PKU,Beijing 100871,China)

ObjectiveTo study effect of high fat diet on serum chemistry and homogenized tissue chemistry on mice,and to construct the an imalmodel for human coronary artery disease orothermetabolis m syndrome。MethodsTotal 63 C57BL/6jmice were randomly divided to 2 groups,feed high fat diet and standard chow diet for 67 days respectively, the bodyweight,food intake,serum and homogenized tissue chemistry,morphological characteristic was studied。ResultsMice feeding high diet showed improved total cholesterol and low density lipoprotein cholesterol,and fat degeneration of hepatocytes。ConclusionThe animalmodel of high choleserol in serum was successfully constructed and can be used in studying of lipid metabolism,arteriosclerosis and othermetabolic syndrome.

High fat diet;Cholesterol;Serum chemistry;Homogenized tissue

R151.4+1

A

1671-7856(2010)01-0041-05

2009-09-14

白慧稱(1986-),女,研究方向:實驗動物。E-mail:baihuichen111@yahoo.com.cn

朱德生(1960-),男,副教授,研究方向:實驗動物管理。E-mail:lac@pku.edu.cn