李小穎,馬春梅,張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京 100021)

人宮頸癌細胞 Hela移植模型腫瘤生長的熒光分析和卡尺測量的比較

李小穎,馬春梅,張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京 100021)

目的建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的人宮頸癌細胞系,建立移植瘤模型并比較移植模型腫瘤生長的熒光分析和卡尺測量的優(yōu)缺點。方法以 Lipofectamine 2000介導(dǎo) chickenβ-actin-GFP-NEO轉(zhuǎn)染人宮頸癌細胞Hela,經(jīng)梯度濃度 G418篩選獲得穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的細胞克隆并擴大培養(yǎng)。BALB/cA-nu裸鼠皮下接種 1× 106個發(fā)光細胞使其成瘤,利用活體熒光成像系統(tǒng)和游標卡尺觀察腫瘤的生長情況。結(jié)果獲得了穩(wěn)定表達 GFP的人宮頸癌細胞株,將其接種到裸鼠體內(nèi)可成瘤。活體熒光成像觀察發(fā)現(xiàn),1至 3周隨著腫瘤體積逐漸增大,平均熒光光子數(shù)逐漸增加;4周時隨著腫瘤出現(xiàn)明顯壞死,平均熒光光子數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢,而游標卡尺測量結(jié)果顯示腫瘤在 4至 5周仍然不斷的增大。結(jié)論綠色熒光蛋白能夠在人宮頸癌細胞 Hela中長期穩(wěn)定表達,用綠色熒光蛋白標記的人宮頸癌細胞 Hela建立的裸鼠腫瘤模型可以為人宮頸癌研究提供理想的實驗材料,應(yīng)用小動物活體成像系統(tǒng)能夠客觀定量評價活的腫瘤細胞在動物體內(nèi)的生長情況,而不是腫瘤體積的變化。

人宮頸癌細胞;裸小鼠;活體熒光成像系統(tǒng);游標卡尺

Hela細胞源自一名美國婦女的子宮頸癌細胞,此細胞株是由正常子宮頸細胞被一種人類乳突狀瘤病毒 (Human Papillomavirus 18或 HPV18)轉(zhuǎn)型成癌細胞的,而且和正常子宮頸癌細胞有許多不同,此細胞顯角蛋白免疫沉淀染色陽性,包含 HPV-18序列,有正常水平的 pRB表達和 p53的低水平表達。本實驗旨在建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的人宮頸癌Hela-GFP細胞系的基礎(chǔ)上,應(yīng)用活體成像技術(shù)動態(tài)觀察細胞在體內(nèi)生長及形成瘤體的過程,比較移植模型腫瘤生長的熒光分析和卡尺測量的優(yōu)缺點,為腫瘤模型的測量和藥物研究提供更方便的分析技術(shù)和實驗材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器:Hela癌細胞本實驗室凍存,L-谷氨酰胺 (G IBCO公司)、雙抗 (G IBCO公司)、DMEM(G IBCO公司)、胎牛血清 (G IBCO公司)、G418(AMRESCO公司)、Lipofectamine 2000 Reagent (I

NV ITROGENE公司)。Whole-body optical imaging system(I.C.E.,日本 Roper公司)、倒置熒光顯微鏡(OLY MPUS IX71)、倒置顯微鏡 (Nikon TS100)。細胞凋亡原位檢測試劑盒 (in situ cell death detection kit,POD)為 ChemiconInternational公司產(chǎn)品。

1.1.2 實驗動物:BALB/cA-nu裸小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司 [XCXK(京)2007-0001],鼠齡 5周,體重 15～18 g,在本實驗室無特定病原體 (specific-pathogen free,SPF)的飼養(yǎng)間飼養(yǎng)。所有實驗操作程序均經(jīng)過實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準(批準號為 GC-09-2001)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):用含 10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素,100μg/mL鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基作為Hela細胞的培養(yǎng)液,于 5%CO2,37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建帶有篩選標記的載體:chickenβ-actin-GFP由本實驗室構(gòu)建[1,2]。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染和篩選:采用 Lipofectamine 2000 Reagent轉(zhuǎn)染 Hela細胞 (具體轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000 Reagent操作說明)。轉(zhuǎn)染后 24 h,用含 500μg/mL G418的培養(yǎng)液篩選細胞 3周,獲得穩(wěn)定表達 GFP的細胞株,選擇其中高表達的克隆株擴大培養(yǎng)。

1.2.4 腫瘤細胞的植入及活體熒光成像:收集處于生長對數(shù)期的轉(zhuǎn)染細胞,稀釋至 5×106/mL。各取三只BALB/cA-nu裸鼠進行皮下接種,1×106個細胞/只,每隔一周觀察一次,飽和三溴乙醇 (0.18 mL/10g)麻醉后放入活體熒光影像系統(tǒng)攝像,Slide Book 4.0軟件進行分析。

1.2.5 腫瘤體積的測定:在接種的 14、21、28和 35 d,分別用游標卡尺測量腫瘤塊 3個互相垂直直徑A、B、C,代入下式計算腫瘤塊的體積 V∶V=1/ 6πABC(V為體積,A、B、C為瘤體的 3個互相垂直的直徑),并繪制腫瘤的生長曲線。

1.2.6 腫瘤組織的 H-E和 TUNEL染色:腫瘤生長5周后,剝?nèi)〕鲆浦擦?制成石蠟切片并進行 H-E和TUNEL染色。TUNEL染色步驟:(1)切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化;(2)20 mg/L蛋白酶 K消化液作用 15 min;(3)含 3%過氧化氫的 PBS,于室溫反應(yīng) 5 min;(4)TUNEL反應(yīng)液,37℃孵育 60 min;(5)過氧化物酶連接的抗熒光素抗體,37℃孵育 30 min; (2)～(5)步后均以 10 mmol/L PBS(pH 7.4)振洗 3次,每次 5 min;(6)DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水透明,封片。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定高表達 GFP的單克隆細胞株

穩(wěn)定高表達 GFP的細胞,在熒光顯微鏡下均呈強熒光,并且熒光較均勻的分布于整個細胞內(nèi)。單克隆 GFP細胞在無 G418篩選壓力下,傳代數(shù)次后仍能穩(wěn)定高水平表達 GFP(圖 1見彩插 2)。細胞形態(tài)和未轉(zhuǎn)染細胞無明顯區(qū)別。

2.2 GFP熒光標記 Hela異種移植瘤模型的動態(tài)觀察

將對數(shù)生長期的 GFP標記的 Hela腫瘤細胞皮下接種于 3只 BALB/cA-nu,1×106/只。在接種的7、14、21、28和 35d觀察腫瘤的生長情況 (圖 2見彩插 2)。1周時腫瘤大小不能用游標卡尺測量,2周時腫瘤進入對數(shù)生長期,至 5周時移植瘤體積可達474.08 mm3,3周時動物皮膚表面都出現(xiàn)了不同程度的壞死。應(yīng)用小動物活體熒光成像系統(tǒng)可監(jiān)測到綠色熒光蛋白在裸小鼠皮下的穩(wěn)定表達,從第 1周至第 3周,隨著腫瘤移植時間的增加,表達綠色熒光蛋白的面積逐漸增大,熒光光子數(shù)也逐漸增加,移植瘤體積與熒光光子數(shù)成正相關(guān)。4周后,由于動物的皮下腫瘤出現(xiàn)了壞死,因此盡管腫瘤體積仍在增加但平均熒光光子數(shù)反而呈下降趨勢,移植瘤體積與熒光光子數(shù)不再有相關(guān)性(圖 3)。

圖 3 Hela移植模型腫瘤生長的熒光分析和卡尺測量的比較Fig.3 The comparison of the tumor growth in implanted mouse model detected by optical imaging system and slide caliper

2.3 H-E和TUNEL染色結(jié)果

H-E染色可見部分腫瘤細胞核染色質(zhì)勻細,核漿比例大,細胞結(jié)構(gòu)完整,處于分裂期的細胞很少,腫瘤生長速度緩慢。另外,大部分細胞呈現(xiàn)核皺縮、濃染,胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強(圖 4A)。

腫瘤組織經(jīng) TUNEL染色,核呈棕黃色,核固縮,染色質(zhì)凝集成塊狀或邊集,呈現(xiàn)細胞凋亡的特征(圖 4B)(圖 4見彩插 3)。

3 討論

子宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一,在全球范圍內(nèi),每年約有 20多萬女性死于宮頸癌。目前宮頸癌的治療方法主要是手術(shù)和放療,手術(shù)療法原則上限于早期患者,且手術(shù)后容易復(fù)發(fā);放射治療適用于各期浸潤型宮頸癌,但放射線缺乏選擇性,對人體正常細胞也會造成傷害,多次放化療以后,患者免疫功能下降,抵抗力降低,容易轉(zhuǎn)移。所以尋找理想的治療方法是當務(wù)之急。目前國內(nèi)外學(xué)者主要集中于各種抗癌藥物的體外抗宮頸癌研究[3-7],由于缺少理想的腫瘤模型,在體抗宮頸癌報道很少。張曉茗[8]建立了 Hela細胞裸鼠移植模型,觀察了大蒜素對裸鼠移植瘤的影響。腫瘤大小的測定采用的是傳統(tǒng)的游標卡尺測量方法,此方法簡單易行,但是早期不敏感,在接種后 2周或更長時間才能測量,并且人為的實驗誤差大,在腫瘤出現(xiàn)壞死后,腫瘤的體積不再代表腫瘤活細胞的多少和生長情況?；铙w生物熒光成像技術(shù) (in vivo bioluminescence imaging)是近年來發(fā)展起來的一項分子、基因表達的分析檢測系統(tǒng),通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄,跟蹤同一觀察目標 (標記細胞及基因)的移動及變化,所得的數(shù)據(jù)更加真實可信。因其操作極其簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點,在剛剛發(fā)展起來的幾年時間內(nèi),已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面[9-12]。

本實驗在成功建立表達綠色熒光蛋白的人宮頸癌細胞系 Hela-GFP的基礎(chǔ)上,將 Hela-GFP細胞接種于裸鼠,通過連續(xù)動態(tài)觀察人宮頸癌細胞在裸小鼠體內(nèi)的生長情況,發(fā)現(xiàn)成像系統(tǒng)在腫瘤皮下移植7 d時就可以檢測到熒光的表達,此時按傳統(tǒng)方法尚無法測量移植瘤體積。隨著移植瘤體積的不斷增加,成像系統(tǒng)可以通過腫瘤組織釋放的平均光子數(shù)客觀地描述腫瘤的生長,在腫瘤的早期,所得數(shù)據(jù)與游標卡尺測量的腫瘤體積相對應(yīng)。至 4周后瘤體出現(xiàn)壞死以后,盡管游標卡尺測量的腫瘤體積仍在增加,但成像系統(tǒng)所測的熒光光子數(shù)反而呈現(xiàn)下降趨勢,利用 HE染色和標記凋亡細胞的 TUNEL染色進一步證實,4周后,位于腫瘤組織中心部分已經(jīng)壞死,與活體熒光成像系統(tǒng)觀察結(jié)果一致,說明只有活的腫瘤細胞才能表達 GFP而產(chǎn)生熒光,利用活體成像系統(tǒng)可以只測量活腫瘤細胞的生長情況,從而更準確地反映腫瘤生長以及與機體的相互作用。

本實驗成功建立了人宮頸癌細胞 Hela綠色熒光標記的腫瘤模型,此熒光蛋白癌癥模型可應(yīng)用于癌癥體內(nèi)用藥的療法中。利用無創(chuàng)傷活體熒光成像對癌細胞生長的檢測,可對癌癥實驗治療之前和過程中的癌細胞的變化進行實時觀測和評估。這種方式提供一個早期、快速、動態(tài)觀察癌細胞的治療反應(yīng)和復(fù)發(fā)評估的預(yù)診斷途徑,為宮頸癌的研究和相關(guān)藥物研究提供了更準確的、更方便的測量技術(shù)和相應(yīng)的動物模型。

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The Comparison of Tumor Growth in the I mplantedM ouseM odel Detected by Optical I maging System and a Slide Caliper

L IXiao-ying,MA Chun-mei,ZHANGLian-feng
(KeyLaboratory of Human Diseases ComparativeMedicine,Ministry of Health;Institute ofLaboratoryAnimal Science,Chinese Academy ofMedical Sciences(CAMS)&ComparativeMedicine Centre, PekingUnionMedical Collage(PUMC),Beijing 100021,China)

ObjectiveTo establish a human cervical carcinoma cell line with stable expression of green fluorescent protein and the fluorescent-labeled implanted tumormodel,and compare the detection methods of tumor growth by optical imaging system and slide caliper.M ethod Human cervical carcinoma cells were transfected with chickenβactin-GFP-NEO byLipofectamine 2000 reagent and screened with G418 to produce the stable GFP-expressing clone.Then the labeled Hela cellswere implanted into the subcutaneous tissue of nude mice and the growth of the implanted tumorwas observed and growth curve of the labeled Hela cellswas analyzed with the whole-body optical imaging system and the slide caliper.Result The stable GFP-expressing Hela cell lines were obtained,which can grow to tumor mass after subcutaneous transplantation.The in vivo fluorescence imaging analysis showed that the fluorescent intensity of tumormass increased with the increase in tumor volume in nude mice during first to third week.The fluorescent intensity tended todecline with the increasing necrosis at the fourth to fifth week,while the tumor volume was still increasing。ConclusionA GFP-labeled Hela cell line and a mouse tumormodel based on the cell linewere established,and the animalmodelprovides useful experimental materials for cervical cancer study. The in vivo fluorescence imaging system could be used to quantitatively evaluate the living tumor cell growth in vivo but not the size or volume of the tumor detected by slide caliper.

Human cervical carcinoma;Nude mouse;Whole-body optical imaging system;Slide caliper

R541

A

1671-7856(2010)01-0015-04

2009-09-15

衛(wèi)生部行業(yè)基金,實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501-026)。

李小穎,助理研究員,主要研究方向:人類疾病動物模型。

張連峰。E-mail:zhanglf@cnilas.org