姜 驪,陳 輝,何 勇,魚 達

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院衛(wèi)生部多器官聯(lián)合移植研究重點實驗室,浙江省器官移植重點實驗室,杭州 310003)

研究報告

高脂飲食加低劑量鏈脲霉素建立小鼠 2型糖尿病模型

姜 驪,陳 輝,何 勇,魚 達

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院衛(wèi)生部多器官聯(lián)合移植研究重點實驗室,浙江省器官移植重點實驗室,杭州 310003)

目的高脂飲食加低劑量鏈脲霉素 (Streptozotocin,STZ)建立小鼠 2型糖尿病模型。方法5周的雄性C57BL/6J小鼠,隨機分為正常飼料組、正常飼料加 STZ組、高脂飼料組和高脂飼料加 STZ組。相應(yīng)飼料喂養(yǎng)5周后,按照 100 mg/Kg的劑量腹腔注射 STZ,然后繼續(xù)喂養(yǎng) 4周。在第 5周和第 9周末測定小鼠的體重、收縮壓、血糖、血胰島素、血甘油三脂和膽固醇水平。結(jié)果STZ注射前各組小鼠的體重、血壓、血糖、血胰島素、血脂和血甘油三脂無明顯差異(P>0.05)。STZ注射后 4周時,高脂飼料加 STZ組小鼠的體重、血糖、血胰島素、血壓和血脂水平明顯升高(P<0.05);而其他三組的這些指標無明顯改變或僅部分升高。結(jié)論高脂飲食加低劑量鏈脲霉素可建立小鼠 2型糖尿病模型,該模型具有人 2型糖尿病的主要表型特征和相似的發(fā)病過程。

2型糖尿病;模型,動物;C57BL/6J小鼠;鏈脲霉素;高脂飲食

2型糖尿病動物模型中應(yīng)用較多的有遺傳因素占主導(dǎo)作用的動物,如 ob/ob小鼠,基因剔除小鼠[1,2]。采用鏈脲霉素 (Streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)注射或反復(fù)誘導(dǎo)的方法[2],經(jīng) STZ注射后,胰島β細胞破壞及功能受損嚴重,獲得的模型接近于 1型糖尿病。因此,建立嚙齒類動物 2型糖尿病模型的方法有必要改進,國內(nèi)對大鼠 2型糖尿病模型的研究比較深入。本研究目的采用高脂飲食加小劑量鏈脲霉素的方法,建立一種經(jīng)濟、操作簡便和類似于人普通 2型糖尿病的小鼠模型,探討并論證其表型特征,為今后的胰島功能康復(fù)研究進行必要的準備。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

STZ購于 Sigma公司,胰島素放免試劑盒購于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司,膽固醇和甘油三脂試劑盒購于南京建成生物工程公司。血糖儀和血糖試紙條為美國強生公司 OneTouch SureStep系列產(chǎn)品。檸檬酸和檸檬酸三鈉購于上海生物工程有限公司。BP-6無創(chuàng)血壓測試儀購于成都泰盟科技有限公司。

1.2 實驗動物

雄性 C57BL/6J小鼠,4周齡,體重 14～16 g,購于中國科學(xué)院上海實驗動物中心[SCXK(滬)2007-0005]。小鼠飼養(yǎng)在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院實驗動物中心,室溫保持在 20℃～25℃,濕度 55%左右。動物自由進食、進水,每天保持 12 h的晝夜循環(huán)。開始實驗前動物適應(yīng)環(huán)境 1周。所有實驗操作符合科技部和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院實驗管理委員會的要求。應(yīng)用隨機數(shù)字表法將小鼠隨機分為正常飼料組(n=8),正常飼料加 STZ組(n =8)、高脂飼料組(n=8)和高脂飼料加 STZ組(n= 8)。

1.3 高脂飼料

參 照 Researcher Diets 公 司 (www. ResearcherDiets.com)的高脂飼料配方,由中國科學(xué)院上海實驗動物中心制作脂肪含量為 45%的高脂飼料,具體配方見表 1。

表 1 高脂飼料各組份的用量和所占成分比,能量和熱卡百分比值Tab.1 Components of high fat food,percentage of the parts and of the energy and calories

1.4 糖尿病小鼠模型建立

小鼠分別給予相應(yīng)飼料喂養(yǎng) 5周,在第 5周末,禁食 8 h。取 200 mg STZ溶于 5 mL的 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中,按照 100 mg/Kg的劑量腹腔注射。STZ注射的整個操作在冰浴上進行,保證整個注射過程在 15 min內(nèi)完成。正常飼料和高脂飼料組小鼠按照 100 mg/Kg腹腔注射 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液。注射后繼續(xù)各自的飼料喂養(yǎng) 4周,在第 9周末,小鼠禁食 8 h后,用滅菌小剪刀剪尾取血,應(yīng)用血糖儀測定血糖,血糖≥16.7 mmol/L被認為糖尿病模型成功。飼養(yǎng)過程中保證充足的水和食物,并每天更換鼠籠和墊料一次。

1.5 收縮壓的測定

使用BP-6無創(chuàng)血壓計,采用尾袖法測量小鼠安靜清醒條件下尾動脈收縮壓。將小鼠在 36℃環(huán)境中預(yù)熱 5 min后,固定于舒適位置,加壓袖口安置于小鼠尾根部,充氣加壓使之超過收縮壓 30 mmHg (壓力達到收縮壓水平時脈搏搏動消失,據(jù)此判斷),然后緩慢減壓,經(jīng)壓力換能器和放大器連接于Medlab生物機能實驗系統(tǒng)記錄血壓。每只小鼠連續(xù)測量 3次,間隔 60 s,取其平均值。

1.6 血糖,血胰島素,膽固醇和甘油三脂和的測定

血糖的測定使用美國強生公司 OneTouch SureStep產(chǎn)品,測定胰島素使用北京科美東雅生物技術(shù)有限公司的胰島素放免試劑盒,測定膽固醇和甘油三脂水平的測定使用南京建成生物工程公司的試劑盒。經(jīng)小鼠的眼內(nèi)眥靜脈取血 4滴,靜置 30 min后,4℃1000 g離心 10 min分離血清,再按照試劑盒的說明書進行操作。其中,胰島素應(yīng)用GAMMA C12全自動γ-計數(shù)儀檢測,膽固醇和甘油三脂應(yīng)用日立 7600全自動生化分析儀檢測。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

實驗組和對照組小鼠在體重、血糖、血胰島素、收縮壓、膽固醇、甘油三酯水平的對比情況見表 2。其中,STZ注射前各組小鼠體重無明顯差異 (P> 0.05)。在 STZ注射后 4周時,高脂飼料組和高脂飼料加 STZ組的體重較正常飼料和正常飼料加 STZ組明顯升高(P<0.05),但兩組之間無明顯差異 (P >0.05)。STZ注射前各組血糖和血胰島素之間無明顯差異(P>0.05)。在 STZ注射后 4周時,高脂飼料加 STZ組的血糖和血胰島素較其它三組明顯升高 (P<0.05);但正常飼料、正常飼料加 STZ和高脂飼料組之間血糖和血胰島素無明顯差異 (P> 0.05)。其中,STZ注射前各組小鼠收縮壓、血膽固醇和甘油三脂之間無明顯差異 (P>0.05)。在 STZ注射后4周時,高脂飼料加 STZ組的收縮壓、血膽固醇和甘油三脂之間較其它三組明顯升高 (P< 0.05)。正常飼料對照、正常飼料加 STZ和高脂飼料對照組之間收縮壓、血膽固醇和甘油三脂無明顯差異(P>0.05)。

表 2 實驗組與對照組體重、收縮壓、血糖、血胰島素、血膽固醇和甘油三脂水平比較 (±s)Tab.2 Comparison of bodyweight,systolic pressure,glucose value,insulin,cholesterin and triglycerides in rats of the experimental and control groups(±s)

表 2 實驗組與對照組體重、收縮壓、血糖、血胰島素、血膽固醇和甘油三脂水平比較 (±s)Tab.2 Comparison of bodyweight,systolic pressure,glucose value,insulin,cholesterin and triglycerides in rats of the experimental and control groups(±s)

注:高脂飼料組和高脂飼料加 STZ組與其他組相比在體重和血胰島素 2個指標上,＊P<0.05;高脂飼料加 STZ組與其他組相比在血糖水平上,＊P<0.05;高脂飼料加 STZ組與其它組相比在收縮壓、血膽固醇、甘油三脂,＊P<0.05。Note:The groups of high fat diet and itwith STZwere significant differences comparingwith other groups in bodyweight and insulin level,＊P<0.05; High fat dietwith STZwas significant differences to other groups in glucose value,＊P<0.05;Fat diet with STZ was significant differences comparing with other groups in systolic pressure,cholesterin and triglycerides,＊P<0.05.

組別 Group體重Bodyweight收縮壓Systolic pressure血糖Glu Value胰島素Insulin血膽固醇Cholesterin甘油三脂Triglycerides STZ前,STZ后Before,4 week STZ前,STZ后Before,4 week STZ前,STZ后Before,4 week STZ前,STZ后Before,4 week STZ前,STZ后Before,4 week STZ前,STZ后Before,4 week正常飼料組 Normal feed 20.4±3.2, 25.4±4.2 100±5.2, 106±6.1 5.6±0.7, 6.4±0.4 15.0±2.1, 15.8±3.1 1.35±0.21, 1.45±0.23 156±0.36, 1.62±0.30高脂飼料組 High fat food 24.6±3.6, 31.5±4.7＊106±5.3, 110±6.5 5.7±0.6, 8.9±0.9 14.0±2.7, 17.6±3.8＊1.60±0.45, 1.70±0.28 1.60±0.51, 1.82±0.33正常飼料 +STZ Normal feed+STZ 19.1±2.3, 22.4±2.8 103±7.0, 104±5.8 5.1±0.3, 9.6±1.0 14.7±3.4, 13.5±2.6 1.30±0.41, 1.36±0.12 1.51±0.33, 1.59±0.24高脂飼料 +STZ High fat food+STZ 23.4±4.1, 29.0±3.3＊102±5.8, 130±7.2 6.2±0.7, 15.5±2.6＊15.2±3.4, 18.9±4.1＊1.59±0.33, 2.35±0.35 1.65±0.37, 5.40±0.46

3 討論

2型糖尿病的病因非常復(fù)雜,涉及到各種遺傳因素和環(huán)境因素以及它們間的相互作用,其主要發(fā)病機制為胰島素抵抗合并相對性分泌不足[3～6]。發(fā)生 2型糖尿病時多表現(xiàn)為高胰島素血癥、高血糖和肥胖,并伴有高血壓、高脂血癥和高膽固醇血癥。本研究中顯示高脂飼料加低劑量 STZ組小鼠在第 9周時血糖、血胰島素、血壓、體重、血甘油三脂和膽固醇均明顯升高,這些癥狀與人 2型糖尿病臨床表現(xiàn)相似。

高脂飼料是一種常用的建立胰島素抵抗和肥胖的方法,根據(jù)脂肪含量的高低和 STZ的用量和次數(shù)的差異,可產(chǎn)生不同的特征,建立不同的類型。本實驗方案是經(jīng)過預(yù)試的,在研究中使用的是動物喜食的脂肪含量為 45%的高脂飼料,該飼料具有很高的誘導(dǎo)胰島素抵抗和肥胖的成功率[7～9]。我們的研究結(jié)果與國內(nèi)外的結(jié)果在主要表型特征和發(fā)病過程方面較一致。值得注意的是 STZ的誘導(dǎo)劑量與動物品系關(guān)系密切,預(yù)試和正式實驗必需采用同一品系的動物,方可使用相同的誘導(dǎo)方案。從這個意義上而論,預(yù)試是建立 2型糖尿病動物模型所經(jīng)常必需的。

STZ為 StreachromogenesUar.128產(chǎn)生的亞硝脲類抗生素,可自行分解活潑的甲基正碳離子,與DNA呈鏈間交叉連結(jié),從而使DNA烷化;也可在體內(nèi)可形成異氰酸鹽,從而與核酸蛋白結(jié)合,抑制DNA多聚酶活力,使受損的 DNA難于修復(fù)。其致糖尿病機制主要是由于胰島細胞中菸酰胺腺嘌呤(DNA)含量減少,STZ分子中的葡萄糖基可使 STZ進入胰島β細胞,引起β細胞核內(nèi)形態(tài)變化,使其染色體凝集、伸長和濃縮。小鼠對 STZ有一定的耐受性,研究顯示注射 150 mg/Kg或者更大劑量可以引起明顯的胰島β細胞受損,使血糖明顯升高,這種方法誘導(dǎo)迅速建立的是 1型糖尿病模型[10,11]。在本研究中使用 100 mg/Kg的 STZ可以使胰島β細胞發(fā)生輕度的受損,使血糖較注射前輕度升高。但是在高脂飼料的導(dǎo)致胰島素抵抗的基礎(chǔ)上,受損的胰島β細胞不足以維持正常的血糖穩(wěn)態(tài),致使血糖顯著升高。

本研究顯示高脂飼料喂養(yǎng) 5周后,給予小劑量的 STZ繼續(xù)喂養(yǎng) 4周可以使小鼠的血壓、體重、血糖、血胰島素、血甘油三脂和膽固醇明顯升高,符合人 2型糖尿病的發(fā)病機制和臨床特點,而且操作簡便、價格便宜,具有人 2型糖尿病的主要表型特征和相似的發(fā)病過程。這說明高脂飼料聯(lián)合低劑量 STZ是一種理想的建立 2型糖尿病模型的方法,可為研究 2型糖尿病的發(fā)病機制,治療方法和研究胰島移植等提供重要的實驗基礎(chǔ)。

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M odel Establishment of Type 2 D iabetesM ellitus Induced by High FatD iet with Low Dose Streptozotocin in C57BL/6JM ice

J IANGLi,CHEN Hui,HE Yong,YU Da
(KeyLaboratory ofMulti-Organ Transplantation,Ministry of Health,the FirstAffiliated Hospital,ZhejiangUniversity School ofMedicine;Zhejing Province KeyLaboratory ofOrgan Transplantation,Hangzhou 310003,China)

ObjectiveTo develop a mice model of type 2 diabetesmellitus(DM)by high fat dietwith low dose streptozotocin(STZ)。MethodsMale C57BL/6J mice at5 weeksof agewere randomly divide into conventional diet(n= 8),conventional dietwith STZ(n=8),high fat diet(n=8)and high fat diet with STZ group(n=8).After the exposure to conventional or high fat diet for 5 weeks,mice were injected intraperitoneallywith 100 mg/kg of either STZ or vehicle solution during fasting state,and kepton the same diet for the next 4 weeks.Bodyweight,systolic blood pressure, blood glucose,serum insulin,serum cholesterol and triglyceride were measured at 5 and 9 weeks,respectively。ResultsThere were no significant differences in body weight,systolic blood pressure,blood glucose,serum insulin,serum cholesterol and triglyceride before injection among four groups(allP>0.05).However,these parameters in high fat diet with STZ group were significantly increased after 4 weeksof injection(allP<0.05).In addition,these parameters showed no essentially change or only part of these parameters markedly increased in other three group after 4 weeks of injection。Conclusions Micemodelof type 2 DM can be successfully developed by high fat dietwith low dose STZ,which preferable mimicks the phenotype characteristics and natural development of humantype 2 DM.

Type-2 diabetesmellitus;Model,animal;C57BL/6J mice;High fat diet;Streptozotocin

R589.1,Q95-33

A

1671-7856(2010)03-0035-04

2009-11-12

姜驪(1981-)男,技術(shù)員,主要從事醫(yī)學(xué)實驗動物模型研究。

魚達。E-mail:dayu46@hotmail.com