張智研 張偉偉

（1、雞東縣第二中學(xué)，黑龍江 雞東 158200 2、齊齊哈爾大學(xué)，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

乙醇作為一種可再生的清潔能源，被作為石油的代用資源而日益受到人們的關(guān)注。以淀粉質(zhì)為原料生產(chǎn)燃料乙醇技術(shù)已經(jīng)成熟，但用木質(zhì)纖維素來生產(chǎn)燃料乙醇更為廉價[l]。玉米秸稈作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的必然產(chǎn)物，是一種十分寶貴的資源。根據(jù)玉米籽的產(chǎn)量推測，2000-2005年間我國玉米秸稈的年產(chǎn)量在1.2-1.48億[2],其有機成分以纖維素、半纖維素為主(纖維素含量占35%以上)[3],近年來正成為研究的熱點。玉米秸稈經(jīng)水解可以轉(zhuǎn)化為還原糖，這些糖類物質(zhì)是生產(chǎn)生物燃料的重要原料[4]。但是玉米秸稈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在常溫下不發(fā)生水解，只有在催化劑存在下，水解過程才顯著地進(jìn)行。纖維素酶可以作為玉米秸稈水解過程的催化劑,在水解過程中會受到各種金屬離子的影響，據(jù)報道，纖維素酶具有廣譜或?qū)Ｐ缘囊种苿?，包?些無機和有機化合物，廣泛存在于自然界中[5],由于某些金屬離子常常是酶的抑制劑或活化劑，為了更好的了解金屬離子和纖維素酶的配伍關(guān)系，采用合適的酶激活劑，本實驗研究了6種不同金屬離子對纖維素酶水解玉米秸稈的影響，以期為玉米秸稈的水解應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

本實驗以干燥的玉米秸稈的外表層組織為實驗材料，取自齊齊哈爾市梅里斯區(qū)玉米地。

1.1.2 藥品試劑

酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、苯酚、無水亞硫酸鈉、蒸餾水、葡萄糖、檸檬酸，NaOH、纖維素酶、Na2HPO4、Tween80、Tween2 0、MnSO4、CoCL2·6H2O、CuSO4、CaCL2、ZnSO4、MgSO4。

1.2 方法

1.2.1 對玉米秸稈的處理

將玉米秸稈用清水沖洗除去其表面的泥沙等雜質(zhì)，烘干，用粉碎機將其粉碎備用。

1.2.2 金屬離子對纖維素酶活力的影響

實驗設(shè)計了 Mn2+、Co2+、Cu2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+6種金屬離子，在纖維素酶水解玉米秸稈的同時將一系列濃度的金屬離子鹽溶液與酶解緩沖液充分混合，水浴30℃反應(yīng)1h后，按照DNS法測定纖維素酶活力的變化。以不加金屬離子的反應(yīng)液作為對照組，每處理重復(fù)3次。

1.2.3 DNS法測酶活

取上述反應(yīng)液1mL加入試管中，加3 mL DNS顯色劑，沸水浴進(jìn)行顯色10 min，520 nm波長,測OD值，以第一管為空白對照管。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線的繪制

準(zhǔn)確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于干燥試管中，使其濃度分別為 0μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL、125 μg/mL、150 μg/mL、175 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL。再分別加入2.5 mL DNS試劑，搖勻，置于沸水中沸煮10 min，冷卻后在520 nm處測吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果和分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2 金屬離子對纖維素酶活力的影響

2.2.1 Mn2+對纖維素酶活力的影響

Mn2+在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，對纖維素酶活力總體呈激活作用。Mn2+濃度從0到0.2 mg/mL時，激活作用增加明顯，0.3 mg/mL以后，激活作用趨于平穩(wěn)，此時OD值維持在0.730左右。

2.2.2 Co2+對纖維素酶活力的影響

Co2+在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，對纖維素酶活力總體呈激活作用。Co2+濃度從0到0.25 mg/mL時，激活作用逐漸增加，0.25 mg/mL達(dá)到最大值以后，激活作用有所降低。

2.2.3 Cu2+對纖維素酶活力的影響

Cu2+濃度從 0 到 0.20 mg/mL，Cu2+對纖維素酶活力呈激活作用，且激活作用逐漸增加，從0.20mg/mL開始，激活作用開始下降。在濃度升高到0.5mg/mL時，Cu2+對纖維素酶的作用轉(zhuǎn)為抑制作用，抑制作用隨濃度增大而加強，0.8 mg/mL后，抑制作用趨于平穩(wěn)。

2.2.4 Ca2+對纖維素酶活力的影響

Ca2+對纖維素酶整活力體呈激活作用，在3.00mg/mL以前，激活作用不顯著，基本維持在OD值為0.1左右。Ca2+濃度在3.00 mg/mL以后，激活作用開始增加。

2.2.5 Zn2+對纖維素酶活力的影響Zn2+對纖維素酶活力整體呈激活作用，在Zn2+濃度為0.30 mg/mL時，激活作用達(dá)到最大以后開始減弱，但依然表現(xiàn)為激活作用。

2.2.6 Mg2+對纖維素酶活力的影響

Mg2+對纖維素酶活力整體呈激活作用，隨著Mg2+濃度的增大，激活作用跟著增加。在Mg2+濃度在0.8-1.6mg/mL之間，激活作用增加幅度平穩(wěn)。

3 討論

酶是蛋白質(zhì)，因此影響蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)改變的因子如物理園子、化學(xué)因子等也會改變酶的活性。金屬離子對酶的作用尤其重要，很多情況下金屬離子是一些酶的的活性中心不可或缺的部分。有關(guān)金屬離子對酶的活性的影響國內(nèi)外已有不少研究[6-8]。金屬離子以3種主要途徑參加催化過程：通過結(jié)合底物為反應(yīng)定向、通過可逆的改變金屬離子的氧化態(tài)調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)、通過靜電穩(wěn)定或屏蔽負(fù)電荷。本研究結(jié)果表明：Mn2+在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，對纖維素酶活力總體呈激活作用。Mn2+濃度從0mg/mL到0.2mg/mL時激活作用明顯增加，0.3mg/mL以后，激活作用趨于平穩(wěn)，此時OD值維持在0.730左右；Co2+在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，對纖維素酶活力總體呈激活作用。Co2+濃度從0mg/mL到0.25mg/mL時激活作用逐漸增加，0.25mg/mL達(dá)到最大值以后，激活作用有所降低；Cu2+濃度從0mg/mL到0.20mg/mL，Cu2+對纖維素酶活力呈激活作用，且激活作用逐漸增加，從0.20mg/mL開始，激活作用開始下降。在濃度升高到0.5mg/mL時Cu2+對纖維素酶的作用轉(zhuǎn)為抑制作用，抑制作用隨濃度增大而加強，0.8mg/mL后抑制作用趨于平穩(wěn)；Ca2+對纖維素酶整活力體呈激活作用，在3.00 mg/mL以上激活作用不顯著，基本維持在OD值為0.1左右。Ca2+濃度在3.00 mg/mL以上，激活作用開始顯著增加；Zn2+對纖維素酶活力整體呈激活作用，在Zn2+濃度為0.30 mg/mL時激活作用達(dá)到最大。以后便開始減弱，但依然表現(xiàn)為激活作用；Mg2+對纖維素酶活力整體呈激活作用，隨著Mg2+濃度的增大，激活作用跟著增加。在Mg2+濃度在0.8-1.6 mg/mL之間，激活作用增加幅度平穩(wěn)。

[1]胡代澤.我國農(nóng)作物秸稈資源的利用現(xiàn)狀與前景[J].資源開發(fā)與市場，2000，l6(1)：19.20.

[2]楊連玉，張國梁，趙穎彩，等.玉米秸稈利用途徑及其在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的綜合利用對策[J].飼料工業(yè)，2005，26(23)：42-45.

[3]王瑞明，關(guān)鳳梅.馬霞，等玉米秸稈水解與木糖酒精發(fā)酵的初步研究 [J].釀酒，2002，29(1)：56 57.

[4]張毅民，呂學(xué)斌，但漢斌，等.一株纖維素分解菌的分離及其粗酶性質(zhì)研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，26(2)：69-72.

[5]趙軍，小倉信夫，磯野昌弘.光肩星天牛的人工飼養(yǎng) (I)[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，21(4)：58-61.

[6]張麗萍，董超，王迎春，等.幾種離子對纖維素酶活力的影響 [J].河北省科學(xué)院學(xué)報.2000，17(4)：235～238.

[7]李衛(wèi)芬，許梓榮，孫建義，鮑康.金屬離子對糖化酶活性的影響[J].1999，25(3)：296-298.

[8]單谷，羅廉，余世袁.金屬離子對纖維素酶制備的影響.[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，1998，18(3)：53-57.