陳巍,林錫煌,戴丹鳳,方柏山

(華僑大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建泉州362021)

短乳桿菌產(chǎn)NADH氧化酶的發(fā)酵及純化

陳巍,林錫煌,戴丹鳳,方柏山

(華僑大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建泉州362021)

有氧環(huán)境下,利用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基,研究短乳桿菌(Lactobacillus brevis)產(chǎn)NADH氧化酶(NOX)的發(fā)酵條件.采用8層紗布,在溫度為30℃,p H=7.0,轉(zhuǎn)速為150 r·min-1的條件下發(fā)酵培養(yǎng)23 h,用p H值為5.8的0.1 mol·L-1磷酸鉀緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌懸浮,超聲波破碎(功率為400 W,超聲2 s,間歇2 s,破碎12 min)后,測得其比活力可達(dá)2.317 m kat·g-1.通過DEA E Sepharose Fast Flow,Macro-Prep High Q和Hydroxyapatite-Ⅰ三步純化后,其純化倍數(shù)為3.11,回收率為8.50%.

NADH氧化酶;短乳桿菌;發(fā)酵;純化

NADH氧化酶(NADH Oxidase,EC 1.6.99.3,簡寫成NOX)在微生物中廣泛存在,在氧氣存在下,它可以直接將NADH氧化為NAD+,產(chǎn)物為H2O(稱為NOX-1)或者H2O2(稱為NOX-2)[1].Condon[2]早在1987年就提出了乳酸細(xì)菌中廣泛存在NOX,在乳酸鏈球菌中,NOX可能是首要的有氧代謝酶.這是因?yàn)?乳酸鏈球菌里氧氣的消耗伴隨著NADH的減少;NOX是在有氧條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的. Park等[3],Yoshitaka等[4]在嗜熱棲熱菌(Therm us thermophilus)和菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)中發(fā)現(xiàn)了NOX-1活力;而Parsonage等[5],Sakamoto等[6]在乳酸細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了NOX-2活力.NOX可用于輔酶再生體系.其中,NOX-1由于催化反應(yīng)會(huì)生成H2O2,易使脫氫酶失活,若用于再生NAD+,則需加入過氧化氫酶.與其他用于輔酶再生的氧化還原酶相比,NOX-2具有以下3個(gè)優(yōu)點(diǎn). (1)NADH以O(shè)2為底物,所以不需要添加新的底物.(2)沒有副產(chǎn)物產(chǎn)生,且終產(chǎn)物水不會(huì)對(duì)與之偶聯(lián)的酶產(chǎn)生抑制.(3)產(chǎn)物容易分離.短乳桿菌屬兼性厭氧菌,是生產(chǎn)NOX-2的重要菌株[7],目前國內(nèi)尚未見關(guān)于該菌種產(chǎn)NOX報(bào)道.本文利用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基探索NOX-2發(fā)酵條件,并進(jìn)行了純化.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌種

短乳桿菌(Lactobacillus brevis),由中國科學(xué)院微生物所提供.

1.2 培養(yǎng)基

(1)種子培養(yǎng)基(1 L):蛋白胨10 g,酵母粉5 g,葡萄糖5 g,醋酸鈉5 g,牛肉膏10 g,磷酸氫二鉀2 g,硫酸鎂0.2 g,硫酸錳0.05 g,檸檬酸二銨2 g,吐溫80 1 g;p H值自然.

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L)[8]:葡萄糖30.6 g,酵母粉11.9 g,氯化銨12 g,硫酸鎂0.05 g,磷酸氫二鉀0.3 g;p H=7.0.

1.3 主要試劑和儀器

NADH、二硫蘇糖醇(DTT)、牛血清白蛋白等(美國Am resco公司);DEAE Sepharose Fast Flow (瑞典Amersham公司);M acro-Prep High Q,Hydroxyapatite-Ⅰ(美國Bio-Rad公司);JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(浙江寧波新芝生物科技股份有限公司);SIGMA-3K30型高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司);UV-2401(PC)S型紫外可見光分光光度計(jì),TB-85型恒溫水浴裝置(日本島津公司);A KTA Purifier制備型全自動(dòng)液相色譜系統(tǒng)(瑞典Amersham公司).

1.4 測定方法

1.4.1 酶活力 酶活力的測定參考Werner等[7]提出的方法并做適當(dāng)修改.NOX-2使O2氧化生成H2O,同時(shí)NADH被氧化為NAD+.NADH在340 nm的紫外光下有最大吸收,根據(jù)吸光度的減少情況,用初速度法可測定NOX-2的活力.反應(yīng)體系中含有0.1 mol·L-1的磷酸鉀緩沖液(p H=7.0),1 mmol·L-1的DTT,0.1 mol·L-1NADH.在37℃條件下,加入適量的酶液啟動(dòng)反應(yīng),用紫外可見光分光光度計(jì),測定波長為340 nm的吸光度D,連續(xù)測1 min,每隔6 s讀取數(shù)據(jù),根據(jù)酶活力單位計(jì)算式計(jì)算酶活(z).有

式(1)中,Vt為反應(yīng)液總體積;Vs為酶液體積;ΔA為每分鐘吸光度變化值;k為樣品稀釋倍數(shù);ε為摩爾吸光系數(shù)(ε=6.3 L·(mmol·cm)-1).酶活力定義:在上述條件下,每分鐘氧化1μmol·L-1NADH的酶量為1個(gè)單位;酶的比活力的定義:每毫克蛋白所含酶的單位數(shù).

1.4.2 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度 采用Bradfo rd法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.4.3 純化步驟 (1)按3 mL的0.1 mol·L-1磷酸鉀緩沖液(p H=5.8)加入1 g培養(yǎng)好的Lactobacillus brevis細(xì)胞的比例制備懸浮液,并加入2 mmol·L-1DTT.經(jīng)過超聲細(xì)胞破碎(功率為400 W,破碎全程時(shí)間為12 min,超聲2 s,間歇2 s),并在冷凍離心機(jī)(10 000 r·min-1)上離心30 min,棄沉淀,所得到上清液即為粗酶液.

(2)將粗酶液上樣到已被含0.2 mol·L-1NaCl的TEA緩沖液(50 mmol·L-1,p H=7.5,含3 mmol·L-1DTT)平衡的DEAE Sepharose Fast Flow填料柱,再用含1 mol·L-1NaCl的TEA緩沖液階躍洗脫,收集酶活性高的洗脫峰.

(3)合并經(jīng)上步洗脫具有較高酶活力的洗脫液,上樣到已被含0.15 mol·L-1NaCl的TEA緩沖液(50 mmol·L-1,p H=7.5,含3 mmol·L-1DTT)平衡的M acro-Prep High Q填料柱;然后,用含1 mol·L-1NaCl的TEA緩沖液(50 mmol·L-1,p H=7.5,含3 mmol·L-1DTT)階躍洗脫,收集酶活性高的洗脫峰.

(4)合并經(jīng)離子交換洗脫具有較高酶活力的洗脫液,上樣到已被含0.2 mol·L-1NaCl的磷酸鈉緩沖液(10 mmol·L-1,p H=6.7,含3 mmol·L-1D TT)平衡的Hydroxyapatite-Ⅰ的填料柱;然后,用含0.2 mol·L-1NaCl的磷酸鈉緩沖液(500 mmol·L-1,p H=6.7,含3 mmo l·L-1D TT)階躍洗脫,收集酶活性高的洗脫峰.

1.4.4 電泳分析 酶的純度及相對(duì)分子質(zhì)量測定為不連續(xù)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺電泳(SDSPAGE)法,采用12%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)NADH氧化酶的影響

2.1.1 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響 采用棉塞,在溫度為30℃,轉(zhuǎn)速為150 r·min-1的條件下連續(xù)發(fā)酵12 h后,考察25,50,100 m L發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)NADH氧化酶的影響.結(jié)果表明,當(dāng)裝液量為25 mL時(shí)酶活力最高,說明溶解氧的提高有利于產(chǎn)酶.

2.1.2 通氣條件對(duì)產(chǎn)酶的影響 短乳桿菌在好氧條件下產(chǎn)酶酶活較高.在其余條件均相同條件下,分別用棉塞、6層紗布、8層紗布、10層紗布進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),結(jié)果如圖1所示.

由圖1中可見,采用8層紗布培養(yǎng)菌時(shí)產(chǎn)酶活力較高.這可能是由于短乳桿菌作為兼性厭氧菌,本身對(duì)氧氣的耐受性有限,過度的氧通量會(huì)對(duì)菌體造成毒害作用,以致對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)NADH氧化酶也會(huì)造成影響.這也預(yù)示著在發(fā)酵罐培養(yǎng)細(xì)胞過程中,溶氧控制是關(guān)鍵因素.

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 采用8層紗布,在溫度為30℃,轉(zhuǎn)速為150 r·min-1,裝液量為50mL的條件下進(jìn)行發(fā)酵,考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶量的影響,結(jié)果如圖2所示.從圖2可以看出,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為23 h時(shí),酶活最高,其值為2.317 m kat·g-1.

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 Fig.2 Effect of fermentation time on enzyme p roduction

圖1 通氣條件對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of aeration condition on enzyme p roduction

2.2 NADH氧化酶的純化

NADH氧化酶的純化過程,如表1所示.表1中,z為酶活力,zt為酶總活力,ρ為蛋白質(zhì)量濃度,σ為比活力,η為回收率,n為純化倍數(shù).

表1 NADH氧化酶的純化Tab.1 Purification of NADH oxidase from Lactobacillus brevis

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),洗滌和懸浮細(xì)胞的緩沖液的p H值對(duì)粗酶液的酶活測定影響較大.在其他條件都相同的情況下,分別用p H值為4.5的0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液,p H值為5.8,7.0的0.1 mol·L-1磷酸鉀緩沖液對(duì)同一批的細(xì)胞進(jìn)行洗滌和懸浮,然后破碎,測其酶活.結(jié)果顯示,緩沖液p H值為4.5,5.8對(duì)酶活的影響相差不大,而緩沖液p H值為7.0時(shí),比活力約為對(duì)比組的1/2.

圖3 NADH氧化酶SDS-PAGE電泳圖Fig.3 Electrophoretogram weight of NADH oxidase by SDS-PAGE

另外,在平衡緩沖液和洗脫緩沖液里加入適量的DTT,能夠減緩純化過程中酶失活的半衰期.這可能與酶活性中心存在對(duì)O2敏感的基團(tuán)有關(guān).

收集經(jīng)Hydroxyapatite-Ⅰ層析所得的活性峰酶液進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示為單一電泳條帶,相對(duì)分子質(zhì)量約為48 ku,如圖3所示.圖3中,M為M arker,1～4分別為粗酶液條帶、DEA E Sepharose Fast Flow層析蛋白質(zhì)條帶、M acro-Prep High Q層析蛋白質(zhì)條帶、Hydroxyapatite-Ⅰ層析蛋白質(zhì)條帶.

3 結(jié)束語

短乳桿菌在有氧條件下誘導(dǎo)生產(chǎn)的NADH氧化酶(NOX-2),對(duì)于構(gòu)建輔酶再生體系方面極具潛力.目前,國外已經(jīng)有一些課題組將之用于酶偶聯(lián),并取得了良好的效果[9-10].通過對(duì)一些發(fā)酵產(chǎn)NADH氧化酶的條件進(jìn)行優(yōu)化,采用8層紗布,在溫度為30℃,p H=7.0,轉(zhuǎn)速為150 r·min-1的條件下發(fā)酵培養(yǎng)23 h,測得其比活為2.317 m kat·g-1.通過DEAE Sepharose Fast Flow,Macro-Prep High Q和Hydroxyapatite-Ⅰ三步純化后,其回收率為8.50%,純化倍數(shù)為3.11.研究的結(jié)果可以為今后構(gòu)建輔酶再生體系工作奠定基礎(chǔ).

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Fermen tation and Purification of NADH Oxidase from Lactobacillus brevis

CHEN Wei,L IN Xi-huang, DA IDan-feng,FANGBai-shan
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology Fujian Province University,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China)

Researches on fermentation conditions of NADH oxidase(NOX)from Lactobacillus brevis were studied in aerobic environment using op timal fermentation medium.Eight layer gauze was used and the Lactobacillus brevis was cultured under 30℃fo r 23 h,w ith p H 7.0 and rotation speed 150 r·min-1.Then the cells were washed and suspended w ith 0.1 mol·L-1K-PBSand disintegrated fo r 12 min using an ultrasonic cell disintegrato r under 400W(pulse 2 s,interval 2 s).The final enzymatic activity obtained was 2.371 m kat·g-1.In the end,the NOX was purified by DEAE Sepharose Fast Flow,Macro-Prep High Q and Hydroxyapatite-Ⅰ,a 3.11 purification fold wasobtained w ith the recovery enzymatic activity of 8.5%.

NADH oxidase;Lactobacillus brevis;fermentation;purification

Q 554+.5

A

(責(zé)任編輯:黃仲一 英文審校:劉源崗)

1000-5013(2010)05-0548-04

2009-03-12

方柏山(1957-),男,教授,主要從事生物化工的研究.E-mail:fangbs@hqu.edu.cn.

國家高技術(shù)研究發(fā)展(863)計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA 020103);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20676048)