楊建嶺 姚智燕 楊藝紅魏 林 (河北醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,石家莊050017)

小鼠白細(xì)胞介素23基因在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)及初步活性研究

楊建嶺 姚智燕 楊藝紅①魏 林 (河北醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,石家莊050017)

目的:克隆小鼠白細(xì)胞介素23(mice interlecukin-23,mIL-23)基因,構(gòu)建高效穩(wěn)定的畢赤酵母表達(dá)菌株,并對(duì)得到的蛋白進(jìn)行生物活性的初步測(cè)定。方法:采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)從pcDNA3-mIL-23上分別擴(kuò)增獲得IL-23的兩亞基p19和p40,并通過(guò)重疊PCR(over-lap PCR)技術(shù)獲得含有連接子的p1940,構(gòu)建pPICZαA-IL-23重組質(zhì)粒;采用甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)重組蛋白,MTT方法檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的促淋巴細(xì)胞增殖情況。結(jié)果:SDS-PAGE分析顯示在誘導(dǎo)24小時(shí)和36小時(shí)后的上清及24～96小時(shí)的沉淀中均可以檢測(cè)到約70 kD的誘導(dǎo)條帶。Western blot印跡法證實(shí)了重組蛋白為特異性蛋白。上清和沉淀中表達(dá)的重組蛋白IL-23能促進(jìn)外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖,OD570 nm分別達(dá)到(0.235±0.029)和(0.216±0.035),而未刺激的對(duì)照組只有(0.135±0.008)和(0.164±0.017)。結(jié)論:成功構(gòu)建出mIL-23的酵母表達(dá)載體,誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白可以明顯地促進(jìn)外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖。

白細(xì)胞介素23;克隆表達(dá);畢赤酵母;生物活性

白細(xì)胞介素23(IL-23)是近期發(fā)現(xiàn)的具有多種效應(yīng)的促炎癥細(xì)胞因子之一,屬于 IL-12家族,由p19和p40兩個(gè)亞基組成[1]。IL-23是類(lèi)似于 IL-6、IL-12的促炎因子,在Th0向Th17細(xì)胞的分化起始及維持Th17分化、發(fā)育中起關(guān)鍵性作用[2,3]。IL-23是由活化的Ⅰ型巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞分泌,可以刺激記憶性T淋巴細(xì)胞的分化和增殖,也可以促進(jìn)IL-17的釋放[1],還是連接固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁[4]。已有研究證實(shí)IL-23與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腸炎、幽門(mén)桿菌引起的胃炎、牛皮癬等炎癥性疾病密切相關(guān)[5,6]。IL-23和IL-12部分地決定了免疫應(yīng)答的走向是Th17還是Th1類(lèi)型,越來(lái)越多的研究表明了IL-23在免疫系統(tǒng)中的重要作用[2,4,7]。

而目前尚無(wú)IL-23在酵母系統(tǒng)中的大量表達(dá)的報(bào)道。為了進(jìn)一步研究IL-23的免疫學(xué)活性及其在Th17發(fā)育過(guò)程中的確切作用機(jī)制,本文通過(guò)基因工程的方法在畢赤酵母中表達(dá)出IL-23蛋白,并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了初步的研究,為深入研究IL-23在免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中扮演的角色和尋找治療慢性炎癥疾病靶位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌 E.coliDH5α、畢赤酵母X-33、質(zhì)粒pcDNA3-mIL-23、pPICZαA由本室保存。1.2 酶及主要試劑 限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、小提質(zhì)粒試劑盒、Taq DNA聚合酶及dNTP均購(gòu)自TaKaRa公司,抗生素Zeocin購(gòu)自Invitrogen公司;兔抗His的一抗和山羊抗兔IgG的熒光二抗為R&D產(chǎn)品,其它試劑皆為分析純。

1.7 mIL-23在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá) 將陽(yáng)性單克隆于25 ml BMGY中,28℃搖培16～18小時(shí),至OD600 nm>2;4 000～5 600 r/min離心5分鐘,收集菌體棄上清,加100～150 ml BMMY稀釋至OD600 nm=1.0,于1 L培養(yǎng)瓶中繼續(xù)28℃搖培。分別在0、6、12、24、36、48小時(shí)時(shí)收集1 ml菌液,離心后上清與沉淀分別凍存。每隔24小時(shí),補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為5%,補(bǔ)加氨水至終濃度0.25%。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western印跡分析上述上清30μl,加入2×SDS-PAGE上樣buffer(50 mmol/L Tris HCl,100 mmol/L DTT,2%SDS,10%甘油)煮沸10分鐘,8 000 r/min離心5分鐘后,上清在10%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳。而上述沉淀則需經(jīng)過(guò)裂解制備樣品,首先在菌體中加100μl的Breaking Buffer懸起,加等量的 acid-washed glass beads(0.5 mm),30秒渦旋,冰上30秒,重復(fù)8次;4℃最大轉(zhuǎn)速離心10分鐘,上清同前述進(jìn)行SDS-PAGE。考馬斯亮蘭染色后,掃描電泳結(jié)果。此外,表達(dá)產(chǎn)物SDSPAGE后采用電轉(zhuǎn)印方法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上,NC膜置于含5%脫脂奶粉的PBST(封閉液,blocking buffer)中室溫封閉過(guò)夜;一抗為兔抗His的單克隆抗體(1∶1 000稀釋),室溫孵育1小時(shí),PBST洗滌3～4次,10 min/次;二抗為熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG,室溫孵育1小時(shí),洗膜后在ODESSY上掃膜。

1.4 克隆構(gòu)建 分別以P19F/P19R、P40F/P40R為引物,質(zhì)粒pcDNA3-mIL-23為模板PCR擴(kuò)增p19和p40。然后分別以p19和p40兩者的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,以p19F/p40R為引物,over-lap PCR擴(kuò)增p1940。p1940與載體pPICZαA同時(shí)經(jīng)XhoⅠ、NotⅠ酶切后,分別回收目的基因和載體片段并連接,T4 DNA連接酶4℃連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化DH5α,于含有25μg/ml Zeocin的LLB上涂板。挑取克隆,進(jìn)行菌體PCR后挑取陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒,應(yīng)用XhoⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定后測(cè)序。

1.5 電擊轉(zhuǎn)化酵母 使用 SacⅠ內(nèi)切酶線性化pPICZαA-mIL23,酶切產(chǎn)物電泳并膠回收純化,定量1 μg線性化的pPICZαA-mIL23加至含有100μl酵母感受態(tài)X-33的2 mm電轉(zhuǎn)杯中,電擊參數(shù):1.5 K V,25 μF,200歐姆,電擊后立即加入1 ml Sorbitol,轉(zhuǎn)入10 ml離心管,30℃靜置1小時(shí)后加入1 ml YPD,30℃, 200 r/min搖1小時(shí),取50～200μl菌液涂于含有100 μg/ml Zeocin的YPDS平板。

1.6 酵母克隆的篩選鑒定 為篩選在AOX1位點(diǎn)同酵母菌發(fā)生重組的Mut+表型克隆。隨機(jī)挑取Zeocin+抗性克隆先后點(diǎn)在MM(1.34%Y NB 4×10-5%biotin 0.5%methanol)、MD(1.34%Y NB 4×10-5%biotin 2%dextrose)上,30℃培養(yǎng)2天。選擇在兩

2 結(jié)果

2.1 pPICZαA-mIL23表達(dá)載體的構(gòu)建篩選鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析,在分子量約為1 007 bp和591 bp位置可見(jiàn)清晰特異的條帶,分別與預(yù)期的p40和p19大小一致。將兩者混合后進(jìn)行重疊PCR,產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析后,在分子量為約

1.6 kb的位置可見(jiàn)清晰條帶,與預(yù)期p1940大小一致。用XhoⅠ/NotⅠ分別將p1940和pPICZαA進(jìn)行雙酶切消化,產(chǎn)物膠回收連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒。構(gòu)建成的pPICZαA/mIL-23酵母表達(dá)載體,進(jìn)行菌體PCR擴(kuò)增和XhoⅠ/NotⅠ雙酶切電泳分析,均可見(jiàn)大小約為1.6 kb的片段,進(jìn)行SacⅠ單酶切后電泳分析可見(jiàn)大小為5.5 kb的片段,而SacⅠ單酶切消化pPICZαA后的電泳分析僅可見(jiàn)3.9 kb的片段。以上鑒定均表明成功構(gòu)建了重組載體pPICZαA/mIL-23,見(jiàn)圖1。

2.2 表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化酵母后的克隆篩選與鑒定線性化的pPICZαA/mIL-23電擊轉(zhuǎn)化酵母菌X-33后,挑取Zeocin+抗性的克隆,進(jìn)行Mut的表型篩選。表型為Mut+的克隆在兩塊板上都會(huì)有良好的生長(zhǎng),而表型為Muts的克隆僅能在MD板上正常生長(zhǎng),而在MM板上則生長(zhǎng)很慢甚至或者就停止生長(zhǎng)。以此判斷的克隆的Mut+克隆以P19F/P40R為引物進(jìn)行菌體PCR。正確重組了mIL-23基因的酵母克隆能夠擴(kuò)增獲得1.6 kb的片段,見(jiàn)圖2。

圖1 pPICZαA-mIL23表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定Fig.1 Construction and identification of pPICZαA-mIL23

圖2 Mut的表型篩選及Mut+克隆的PCR鑒定Fig.2 Determining the Mut Phenotype and PCR identification of Mut+clones

圖3 重組質(zhì)粒工程菌表達(dá) IL-23產(chǎn)物的 SDS-PAGE及Western blotFig.3 Analysis of IL-23 expression in engineered yeast by SDS-PAGEand Western blot

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE及Western blot 表達(dá)載體在BMMY和BMGY中通過(guò)甲醇和氨水誘導(dǎo)后,對(duì)各組樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳:發(fā)現(xiàn)在24、36小時(shí)的上清中可以檢測(cè)到大小為70 kD左右的蛋白。同時(shí),誘導(dǎo)了24、36小時(shí)的沉淀也可以檢測(cè)到誘導(dǎo)條帶,而空載體誘導(dǎo)后的上清及沉淀均未檢測(cè)到相同的誘導(dǎo)條帶。由于在表達(dá)載體pPICZαA上帶有his標(biāo)簽,而Western免疫印跡表明表達(dá)產(chǎn)物與兔抗His的單克隆抗體有特異性結(jié)合,且對(duì)應(yīng)了mIL-23加上α-factor及his的蛋白分子量大小,證實(shí)誘導(dǎo)表達(dá)獲得了預(yù)期的蛋白,見(jiàn)圖3。

圖4 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用Fig.4 The promotion effect of induced products on the proliferation of PBMC

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的生物活性測(cè)定 為了檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性,我們應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了其對(duì)PBMC的增殖影響。獲得的表達(dá)產(chǎn)物較明顯的刺激了PBMC的增殖,24、36小時(shí)的誘導(dǎo)上清及沉淀均使OD570 nm值達(dá)到0.216以上,而未誘導(dǎo)的對(duì)照組及空白組只有0.134,提示獲得的誘導(dǎo)產(chǎn)物mL-23具有其生物學(xué)活性,見(jiàn)圖4。

3 討論

作為一個(gè)在結(jié)構(gòu)和功能上同IL-12類(lèi)似的免疫分子——IL-23,近期已經(jīng)成為細(xì)胞因子研究中的熱點(diǎn)。IL-23是一類(lèi)異二聚體,由一個(gè)19 kD的α亞基和一個(gè)40 kD的β亞基共同折疊而成[1,2]。小鼠和人類(lèi)IL-23p19亞基具有70%的同源性,并且與IL-12p35也具有很高的同源性。此外,IL-23和IL-12含有共同的p40亞基和受體 IL-12 Rβ1[2]。這說(shuō)明 IL-23與IL-12在功能上有一定的相似性,但又不完全相同。在動(dòng)物模型和人體上的實(shí)驗(yàn)都表明了IL-23在起始和產(chǎn)生免疫應(yīng)答方面起著重要作用。相反, IL-23的表達(dá)失控,會(huì)加劇炎性疾病的發(fā)生[8]。

具有生物活性的IL-23的合成,要求p40和p19是在同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的[2,4]。再加上 IL-23的分子量(60 kD左右)較大,使得在真核系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)IL-23變得較為困難。為了mIL-23在翻譯后較易折疊修飾成有活性的蛋白,本研究在p19和p40兩亞基間添加了5個(gè)中性氨基酸的連接子將其克隆至畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα-A。此載體為高效的酵母融合表達(dá)載體,其N(xiāo)-端具有α-factor信號(hào)肽同時(shí) C端有6×His標(biāo)簽,使得所表達(dá)的蛋白可以分泌到胞外而且便于鑒定。因此我們獲得的mIL-23酵母表達(dá)菌株誘導(dǎo)后,在上清和沉淀中均有表達(dá)。我們的研究與文獻(xiàn)報(bào)道相一致,與對(duì)照組的空載體相比,克隆了mIL-23的實(shí)驗(yàn)組明顯促進(jìn)了PBMC的增殖,并證實(shí)了誘導(dǎo)后的產(chǎn)物具有生物學(xué)活性。而已有研究表明,IL-23是一類(lèi)重要的炎性細(xì)胞因子,不僅參與Th1型免疫應(yīng)答而且與Th0向Th17的分化及IL-17的分泌相關(guān)[3]。IL-23/IL-17軸線的免疫調(diào)節(jié)和IL-23在慢性炎癥疾病中的發(fā)生發(fā)展上都與IL-23密切相關(guān)[5,9]。因此,我們成功獲得的mIL-23表達(dá)菌株不僅為進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),而且為慢性炎癥疾病的治療提供了新的方法和途徑。

1 Beadling C,Slifka M K.Regulation of innate and adaptive immune responses by the related cytokines IL-12,IL-23,and IL-27[J].Arch Immunol Ther Exp,2006;54(1):15-24.

2 Van de Vosse E,Lichtenauer-Kaligis E G,van Dissel J Tet al.Genetic variations in the interleukin-12/interleukin-23 receptor(beta1)chain, and implications for IL-12 and IL-23 receptor structure and function[J]. Immunogenetics,2003;54(12):817-829.

3 McKenzie B S,Kastelein R A,Cua D J.Understanding the IL-23-IL-17 immune pathway[J].Trends Immunol,2006;27(1):17-23.

4 Langrish CL,McKenzie B S,Wilson N Jet al.IL-12 and IL-23:master regulators of innate and adaptive immunity[J].Immunnol Rev,2004;202: 96-105.

5 Caruso R,Pallone F,Monteleone G.Emerging role of IL-23/17 axis in H pyloriassociated pathology[J].World J Gastroenterol,2007;13(42): 5547-5551.

6 Hue S,Ahern P,Buonocore Set al.Interleukin-23 drives innate and T cell-mediated intestinal inflammation[J].J Exp Med,2006;203(11): 2473-2483.

7 Lankford C S,Frucht D M.A unique role for IL-23 in promoting cellular immunity[J].J Leukoc Biol,2003;73(1):49-56.

8 Ghiladri N,K lajavin N,Chen Qet al.Compromisedhumoral and delayedtype hypersensitivity responses in IL-23 deficient mice[J].J Immunol, 2004;172(5):2827-2833.

9 K ikly K,LiuL,Na Set al.The IL-23/Th(17)axis:therapeutic targetsfor autoimmune inflammation[J].Curr Opin Immunol,2006;18(6):670-675.

[收稿2009-08-23 修回2009-11-04]

(編輯 倪 鵬)

Expression of mice interlecukin-23 in pichia and preliminary studies on its biology function

YANG Jian-Ling,YAO Zhi-Yan,YANG Yi-Hong,WEI Lin.Department of Immunology,Hebei Medical University,Shijia zhuang050017,China

Objective:T o clone the mice interleukin-23(mIL-23)and express it in Pichia efficiently.Methods:Two subunits of IL-23 were amplified by PCR from pcDNA3/mIL-23,and ligated together with adaptor by over-PCR.The IL-23 cDNA confirmed by sequencing was inserted into expressing vector pPICZαA and expressed inPichiaX-33 strain.IL-23 protein expression was induced by methanol and ammonia. The recombinant IL-23 was identified by immunoblot and its biological activity was analyzed.Results:DNA sequencing confirmed that cloned cDNA was identical to the published sequence of mIL-23.The recombinant plasmid pPICZαA/mIL-23 was electroprated into X-33.An expected 72 kD protein of mIL-23 wasfounded both in the induced pellets and supermatants by SDS-PAGE and coomassie blue staining.The 72 kD protein could be recognized in Western blot.While we could detect bands at 72 kD in cell pellets induced more than 24 h by Western blot.Detected by Western blot using anti-His antibody,we could see positive band at 72 kDfrom supernatants induced 24 and 36 h.While we could detect band at 72 kD in cell pellets induced between 24 h and 96 h.Meanwhile,we could see obviously proliferation of mice peripheral blood mononuclear cells(PBMC)treated with the induced pellets and supermanants.Conclusion:We have successfully expressed mIL-23 protein inPichia and the expressed product has its bioactivity in promoting the proliferation on PBMC.

IL-23;Gene clone and exprssion;Pichia;Bioactivity

R392.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-484X(2010)02-0120-04

①河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細(xì)胞研究室,石家莊050016

楊建嶺(1981年-),男,碩士,助教,主要從事感染免疫的研究,E-mail:yjianling@126.com;

及指導(dǎo)教師:魏 林(1961年-),女,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事感染免疫學(xué)研究,E-mail:weilin21@ sina.com。