河南金丹乳酸有限公司乳酸工程技術(shù)研究中心崔耀軍張國(guó)宣南京工業(yè)大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院虞龍

低能離子注入L-乳酸生產(chǎn)菌生物學(xué)效應(yīng)的研究*

河南金丹乳酸有限公司乳酸工程技術(shù)研究中心崔耀軍張國(guó)宣
南京工業(yè)大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院虞龍

乳酸是目前世界上公認(rèn)的3大有機(jī)酸之一，其廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、制革、紡織、環(huán)保和農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域。目前隨著白色泡沫污染日益嚴(yán)重，可生物降解的聚乳酸產(chǎn)品作為有可能取代造成環(huán)境污染的白色熱塑產(chǎn)品也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。目前，化學(xué)合成法生產(chǎn)乳酸均為DL型，無(wú)法達(dá)到聚L-乳酸的要求。而用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸可以得到較高的純度要求。本研究以低能氮離子注入L-乳酸菌，篩選到一株產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高10%的高產(chǎn)株RS12-6c。

一、材料與方法

1.菌種。凝結(jié)芽孢桿菌Bacilluscoagulans，中國(guó)菌種保藏中心。

2.培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，牛肉膏3，酵母膏3，葡萄糖5，MgSO4·7H2O0.5。

篩選培養(yǎng)基：高葡萄糖平板：基本培養(yǎng)基中加30%葡萄糖。純?nèi)樗崞桨澹阂?.5%的乳酸代替基本培養(yǎng)基中的葡萄糖。琥珀酸平板：以2%的琥珀酸代替基本培養(yǎng)基中的葡萄糖。種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖60，酵母膏10，蛋白胨10，MgSO4·7H2O 0.5。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖150，酵母膏15，蛋白胨5，MgSO4·7H2O 0.5。

3.低能離子注入工藝與樣品處理。取培養(yǎng)20h的種子液稀釋10倍，取0.1mL均勻涂布于無(wú)菌平皿上，以無(wú)菌風(fēng)吹干。取鏡檢無(wú)細(xì)胞重疊者進(jìn)行離子注入。離子注入機(jī)為L(zhǎng)ZD900多功能離子注入機(jī)（本研究室配備），使用以20keV氮離子不同劑量進(jìn)行注入，靶室真空度為10-3Pa。將平皿置于靶臺(tái)上，以5s脈沖式注入，間隔15s，然后取出平皿，以1mL無(wú)菌水洗脫，涂平板培養(yǎng)基，于45℃培養(yǎng)2～3天用于單菌落的挑選和存活率的計(jì)算。

4.篩選方法。

（1）初篩。將經(jīng)離子束注入后的平板用無(wú)菌水洗下，涂布于高糖平板。將生長(zhǎng)狀況良好的菌株用牙簽挑到高乳酸平板上，篩選能生長(zhǎng)的菌株，然后將篩選的菌株挑到琥珀酸平板和純?nèi)樗崞桨迳线M(jìn)一步篩選。篩選在琥珀酸平板上比出發(fā)菌株延遲出現(xiàn)菌落的菌株，即強(qiáng)化EMP途徑、減弱TCA循環(huán)的變異株。篩選在純?nèi)樗崞桨迳喜簧L(zhǎng)，即篩選出不分解利用乳酸的菌株。

（2）復(fù)篩。將初篩獲得的菌株經(jīng)種子培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基逐個(gè)發(fā)酵，進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定。

5.突變率的計(jì)算。取接受輻照后的單菌落分別進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以出發(fā)菌作為對(duì)照，考察菌株的產(chǎn)酸能力。其中產(chǎn)酸比出發(fā)菌株低5%的視為負(fù)突變菌株，大于5%為正突變菌株，在5%以?xún)?nèi)的視為無(wú)義異株。負(fù)突變率是指負(fù)突變菌株占全部被考察的菌株的比率，正突變率指正突變菌株占全部被考察的菌株的比率。

6.分析方法。

（1）pH值測(cè)定。采用上海雷磁pHS-3B型精密pH計(jì)。

（2）菌體濃度測(cè)定。采用分光光度法。

（3）發(fā)酵液中乳酸鈣的測(cè)定。采用EDTA滴定法。

（4）乳酸含量測(cè)定。采用高效液相色譜法。

二、結(jié)果與討論

1.存活曲線。從存活率曲線上可以看出其與文獻(xiàn)報(bào)道的“馬鞍形”曲線基本吻合，但不同之處是在實(shí)驗(yàn)中存活率的第一次下降不是緩慢的，而是在很低的劑量下就出現(xiàn)了存活率的驟降。還有一點(diǎn)與其他類(lèi)似菌種注入報(bào)道不同，曲線上出現(xiàn)了兩個(gè)峰。在低劑量時(shí)存活率急劇下降，隨著劑量的增加，存活率有短暫回升，后又逐漸下降，但在中高劑量下又有緩慢的回升最后再逐漸下降。而且筆者在20keV及其他能量下多次試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。

圖1 N+離子注入凝結(jié)芽孢桿菌的存活率曲線

相關(guān)研究指出，離子注入細(xì)胞的射程較短，低劑量時(shí)離子只對(duì)細(xì)胞表面進(jìn)行損傷和刻蝕，能量沉積所產(chǎn)生的大量自由基亦會(huì)導(dǎo)致DNA和生物膜等其他生物大分子的損傷，從而都造成存活率下降。針對(duì)圖1出現(xiàn)存活率的兩個(gè)短暫回復(fù)峰，筆者認(rèn)為可能是菌體內(nèi)修復(fù)酶的激活及注入電荷積累形成的“保護(hù)屏障”，在時(shí)間上存在著先后差別，從而使存活率出現(xiàn)兩個(gè)回復(fù)峰。

2.菌種篩選。將經(jīng)過(guò)篩選平板挑出的菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基逐個(gè)發(fā)酵，進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定。同時(shí)與出發(fā)菌株對(duì)照計(jì)算突變率。挑取產(chǎn)酸高的菌株，進(jìn)一步發(fā)酵驗(yàn)證。得到的高產(chǎn)菌株，經(jīng)遺傳穩(wěn)定驗(yàn)證后，進(jìn)入下一輪誘變篩選。

圖2 N+離子注入凝結(jié)芽孢桿菌的突變率

由圖2可以看出在劑量范圍在100×1013ions/cm2～200× 1013ions/cm2之間時(shí)正突變率比較高。經(jīng)20keVN+離子注入，篩選出1株高產(chǎn)突變菌株，其L-乳酸生產(chǎn)能力有了顯著的提高，將其命名為Bacillus coagulans RS12-6C。

為了確保篩選到的高產(chǎn)菌BacilluscoagulansRS12-6C的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)其做了遺傳穩(wěn)定性考察。每代實(shí)驗(yàn)過(guò)程：高產(chǎn)菌株自然分離→單菌落→斜面→種瓶→搖瓶發(fā)酵，測(cè)L-乳酸產(chǎn)量。共傳5代，每代均做3個(gè)平行樣，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 高產(chǎn)突變株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

由表1可以看出，在投糖15%的情況下，產(chǎn)酸基本維持在117g/L左右，說(shuō)明該菌遺傳穩(wěn)定性較好。

3.發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。

（1）碳源對(duì)發(fā)酵的影響。分別以含糖量為150g/L的葡萄糖、大米糖化液、玉米粉糖化液、木薯粉糖化液作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，其他組分均相同進(jìn)行發(fā)酵。其中，大米、玉米粉及木薯粉均采用高溫淀粉酶及α糖化酶進(jìn)行雙酶水解后補(bǔ)足葡萄糖使用。在45℃進(jìn)行發(fā)酵72h后，測(cè)L—乳酸產(chǎn)量。

研究表明，葡萄糖、大米糖化液、玉米粉糖化液對(duì)L—乳酸發(fā)酵影響相差不大，蔗糖基本不能被利用發(fā)酵，其中葡萄糖為最佳碳源。從原料來(lái)源和成本角度考慮，本研究采用玉米粉糖化液為碳源。

（2）不同氮源對(duì)發(fā)酵的影響。乳酸發(fā)酵屬于初級(jí)代謝過(guò)程產(chǎn)酸量隨著菌體的增長(zhǎng)迅速增加，發(fā)酵時(shí)添加的氮源過(guò)少，不利于菌體生長(zhǎng)，發(fā)酵產(chǎn)酸減少。但加入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)多，菌體生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，發(fā)酵速度快，但菌體消耗過(guò)多的營(yíng)養(yǎng)用于生長(zhǎng)，產(chǎn)酸的量下降。以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)加入含氮量大致相同的不同氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分別為酵母膏1.5%、蛋白胨1.5%、豆粕水解液2%、玉米漿1.5%、棉籽蛋白2%，于45℃發(fā)酵72h。

結(jié)果表明，酵母膏是該菌發(fā)酵的最適氮源?？赡苁怯捎谠摼菭I(yíng)養(yǎng)缺陷型，而酵母膏中富含豐富的氨基酸、維生素等活性因子有利于菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酸。但酵母膏成本太高在大規(guī)模發(fā)酵中不可能使用，可以考慮增加其他氮源減少酵母膏用量或?qū)ふ腋训目商娲湍父嗟牡矗@也是下一步需要進(jìn)行的工作。

4.發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化。

（1）搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酸的影響。實(shí)驗(yàn)分別以靜置，50rpm，100rpm，150rpm，200rpm轉(zhuǎn)速，發(fā)酵至終點(diǎn)，測(cè)產(chǎn)酸。

結(jié)果表明，在50rpm下振蕩培養(yǎng)比其他轉(zhuǎn)速及靜置培養(yǎng)產(chǎn)酸都高。由此可見(jiàn)該菌是兼性厭氧菌，在有少量氧存在的情況下可促進(jìn)菌體生長(zhǎng)及乳酸的產(chǎn)生。但文獻(xiàn)報(bào)道乳酸多在靜止發(fā)酵。故又設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)：分別以0rpm，50rpm，100rpm，150rpm，200rpm各轉(zhuǎn)速下，先震蕩6h，12h，18h后轉(zhuǎn)入靜置發(fā)酵，共13種發(fā)酵方式。結(jié)果表明，100rpm搖床振蕩12h后轉(zhuǎn)入靜置培養(yǎng)，產(chǎn)酸最高。可能是由于該菌是兼性厭氧菌，在發(fā)酵前期通入少量分子氧，使菌體濃度迅速增長(zhǎng)。然而，L-乳酸的發(fā)酵機(jī)制為葡萄糖經(jīng)EMP途徑生成丙酮酸，丙酮酸在L-乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸，這一過(guò)程在厭氧條件下能夠較好的實(shí)現(xiàn)。故當(dāng)菌體濃度達(dá)到一定程度后轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵，可使乳酸產(chǎn)量迅速積累。

（2）溫度對(duì)發(fā)酵的影響。有文獻(xiàn)報(bào)道凝結(jié)芽孢桿菌屬于嗜熱菌在微通氧情況下其生長(zhǎng)溫度可達(dá)75℃以上。分別在不同溫度下發(fā)酵測(cè)L-乳酸產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在45℃到60℃之間產(chǎn)量基本比較穩(wěn)定，其中以55℃為最好。故確定最佳發(fā)酵溫度為55℃。在這一溫度下，普通細(xì)菌尤其是發(fā)酵中易混入的德氏乳桿菌難以生長(zhǎng)，減少了染菌的機(jī)會(huì)，從而可以較好地保證產(chǎn)物的光學(xué)純度及以后在大罐發(fā)酵中可以減少冷凝水用量。

5.高產(chǎn)菌株發(fā)酵特性。將經(jīng)過(guò)多輪篩選獲得的L-乳酸高產(chǎn)菌株RS12-6C在以上優(yōu)化基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每隔6h觀察培養(yǎng)并取樣檢測(cè)繪制發(fā)酵曲線。

實(shí)驗(yàn)表明，由于發(fā)酵瓶中加入過(guò)量輕質(zhì)碳酸鈣，整個(gè)過(guò)程pH值基本維持在6.8左右，而此pH值是凝結(jié)芽孢桿菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酸的較佳范圍。從OD值的變化可以看出，菌體生長(zhǎng)速度較快，24h后OD值已經(jīng)達(dá)到最大，此時(shí)菌種亦進(jìn)入高速產(chǎn)酸階段。乳酸發(fā)酵屬于初級(jí)代謝過(guò)程，隨著生物量的積累，L-乳酸產(chǎn)量迅速增長(zhǎng)。54h達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)到約117g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到80%左右。

三、結(jié)論

通過(guò)運(yùn)用離子注入技術(shù)誘變選育L-乳酸生產(chǎn)菌凝結(jié)芽孢桿菌，總結(jié)離子束注入微生物的生物學(xué)效應(yīng)，在工業(yè)微生物遺傳改良的新方法上進(jìn)行了初步有益的嘗試。經(jīng)多輪離子注入篩選到一株高產(chǎn)突變菌株RS12-6C，與出發(fā)菌株相比產(chǎn)酸性能提高了約10%，其L-乳酸產(chǎn)量達(dá)到117g/L左右。同時(shí)，對(duì)RS12-6C的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，確定了碳氮源濃度、發(fā)酵溫度及控氧條件，為進(jìn)一步發(fā)酵罐上條件研究提供了參考依據(jù)。

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國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）引導(dǎo)項(xiàng)目（2005AA001180）。