劉開永， 張 敏， 李道敏， 郭金英， 李松彪， 侯玉澤

(1.河南科技大學(xué)食品生物工程學(xué)院，河南洛陽 471003;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642)

超微粉碎技術(shù)能提高一些中藥材的生物利用度，解決煎煮的麻煩和有效成分在煎煮過程中受熱分解及水解被破壞的問題。一般認為，其顆粒粒徑應(yīng)在1～75 μm范圍內(nèi)，大多數(shù)微米中藥平均粒徑小于或等于15 μm時，即可稱之為超微粉［1-2］。對于中藥超微粉體而言，隨著顆粒粒度的細化，呈現(xiàn)出一系列的特殊性質(zhì)，這些性質(zhì)對中藥粉體有效成分的溶出有重要影響，因此，有必要對不同粒度的穿心蓮粉體進行溶出量和溶出速率實驗，在此基礎(chǔ)上進行溶出動力學(xué)分析，探討其有效成分的溶出特性和中藥微細化的適度粉碎程度，初步建立穿心蓮有效成分溶出特性與顆粒性能的相關(guān)性評價其藥效和指導(dǎo)中藥超微細粉體的應(yīng)用［3-5］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 穿心蓮超微粉(D50=3.16 μm)和D50=30 μm，D50=50 μm，D50=150 μm 3 種粒徑較大的微粉，由南京天目超微粉公司訂制，南京化工大學(xué)提供粒度測試。穿心蓮全草來自廣東嶺南中藥廠。穿心蓮內(nèi)酯(批號:050807)和脫水穿心蓮內(nèi)酯標準品(批號:050506)購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 儀器 BMF-6型倍力微粉機(德國);FZ-102微型植物試樣粉碎機(河北黃弊市齊家務(wù)科學(xué)儀器廠)。ZRS-8G型智能溶出儀(天津大學(xué)無線電設(shè)備廠)。NSKC-1激光粒度測定儀(Malvern，UK)。

液相色譜儀:Waters 2695分離系統(tǒng)、在線負壓脫氣機、2487紫外檢測器、自動進樣器、柱溫箱，Empower色譜工作站，美國Waters公司。ZRS-8G型智能溶出儀(天津大學(xué)無線電設(shè)備廠)。保護柱:C18，4 mm×3.0 mm(i.d)，美國Phenomenex公司。固相萃取真空歧管裝置 配備真空泵，連接頭，20管，美國Waters公司或Supelco公司。SPE柱Strata-XC，60 mg/3 mL，美國 Phenomenex 公司。

1.1.3 試劑 乙腈、甲醇，色譜純，為FISHER公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 流動相組成:A為0.5%甲酸水溶液，B為0.5%甲酸乙腈。穿心蓮內(nèi)酯流動相是A-B為30∶70(V/V)，流速 0.8 mL/min，檢測波長225 nm;進樣量20 μL;柱溫35℃。

脫水穿心蓮內(nèi)酯的流動相A-B為47∶53(V/V)，流速1 mL/min，檢測波長255 nm;進樣量20 μL;柱溫35℃。

1.2.2 標準曲線 精密量取穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯標準工作混合液1 mL，采用2倍稀釋法用流動相倍比稀釋，得到 12.8、6.4、3.2、1.6、0.8 μg/mL 系列標準濃度，進樣 20 μL。峰面積與對應(yīng)濃度線性回歸，得穿心蓮內(nèi)酯校正曲線為:y=52 897x-1 829.5(r=0.999 8);脫水穿心蓮內(nèi)酯校正曲線:y=13 224x-457(r=0.999 7)。兩成分在0.8～12.8 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.3 樣品處理 平行精密稱取超微粉(D50=3.16 μm)和 D50=30 μm、D50=50 μm、D50=150 μm(普通)3 種粒徑較大的微粉3份，每份0.50 g置于40% 甲醇的500 mL水溶液里(已經(jīng)預(yù)熱至37℃)，啟動儀器，轉(zhuǎn)速100 r/min，于5、10、30、40、50、60、80、100、120、140、160 min 時取樣 1 mL，再補充1 mL 40%的甲醇水溶液，取出的1 mL試樣用0.22 μm尼龍濾器過濾，用重蒸水10倍稀釋，用適量石油醚振蕩脫色脫脂。

SPE凈化:取脫脂后的適量上清液倒入以3 mL甲醇活化、3 mL純凈水平衡的反相聚合物SPE柱(Strata-X)中，3 mL純凈水和3 mL×10% 甲醇淋洗，負壓抽干;3 mL甲醇洗脫藥物，收集洗脫液。

樣品溶解:將洗脫液于60～70℃氮氣吹干，用1.0 mL流動相A溶解殘留物，旋渦混勻，8 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入自動樣品瓶(2 mL，Waters公司)，進行HPLC測定。

1.2.4 回收率試驗 精密稱取不同質(zhì)量穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯各4份，分別添加到精密的稱取0.50 g穿心蓮超微粉中，按1.2.3項中樣品處理方法處理，計算加樣回收率和變異系數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 SPSS 10.0軟件對上述數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 回收率和變異系數(shù)

從方法上，兩藥的回收率在88.28% ～94.53%，變異系數(shù)均小于2%。相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。

表1 穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯加樣回收試驗

2.2 穿心蓮內(nèi)酯溶出濃度和溶出曲線

從表2可見，D50為3.16 μm的超微粉在5～40 min時間段內(nèi)，穿心蓮內(nèi)酯的溶出率較大，在50～160 min內(nèi)溶出率變化較小，在100 min中后基本沒有變化，此時達到溶出平衡，而其他3種粉體在整個過程中，溶出率的變化不大，在40 min后基本達到溶出平衡狀態(tài)。D50為3.16 μm的超微粉的穿心蓮內(nèi)酯的溶出量約為普通粉的5倍，也是其他兩粉體的2～3倍。4種粉體以溶出濃度的自然對數(shù)對時間進行線性回歸分析，得到 D50=3.16 μm，D50=30 μm，D50=50 μm，D50=150 μm的粉體的直線方程分別為:Y=0.708 4 LnX+5.157 4(r=0.960 3);Y=0.120 1 LnX+2.907(r=0.945 2);Y=0.108 2LnX+2.282 4(r=0.893 5);Y=0.094 2 LnX+1.257 8(r=0.888 1)。

表2 4種粒徑粉體中穿心蓮內(nèi)酯的溶出度(±s，n=3)

表2 4種粒徑粉體中穿心蓮內(nèi)酯的溶出度(±s，n=3)

時間/min D50=3.16 μm/(μg/mL)D50=30 μm/(μg/mL)D50=50 μm/(μg/mL)D50=150 μm/(μg/mL)5 6.20±0.36 2.95±0.12 2.38±0.15 1.45±0.11 10 6.40±0.31 3.25±0.15 2.42±0.21 1.48±0.09 20 7.50±0.28 3.38±0.21 2.55±0.16 1.47±0.12 40 8.07±0.21 3.40±0.17 2.75±0.17 1.51±0.06 50 8.14±0.18 3.42±0.21 2.75±0.33 1.63±0.12 60 8.23±0.32 3.42±0.22 2.66±0.21 1.69±0.09 80 8.33±0.56 3.42±0.35 2.74±0.14 1.69±0.08 100 8.42±0.28 3.43±0.25 2.70±0.09 1.72±0.07 120 8.43±0.12 3.45±0.13 2.65±0.12 1.73±0.12 140 8.45±0.10 3.46±0.19 2.75±0.19 1.73±0.06 160 8.44±0.53 3.49±0.17 2.76±0.20 1.72±0.08

穿心蓮內(nèi)酯的溶出度與時間的變化相關(guān)性較好，r在0.88～0.96之間，在限定的的溶出條件下，一定的粒度范圍內(nèi)，可以得到溶出速率和顆粒的關(guān)系，即粒徑的大小與溶出率的負相關(guān)關(guān)系。

2.3 脫水穿心蓮內(nèi)酯溶出濃度和溶出曲線

從表3見，D50為3.16 μm 的超微粉在5～40 min，脫水穿心蓮內(nèi)酯的溶出率較大，在50～160 min內(nèi)溶出率變化較小，在100 min中后基本沒有變化，此時達到溶出平衡，而其他3種粉體在整個過程中，溶出率的變化不大，在40 min后基本達到溶出平衡狀態(tài)。D50=3.16 μm的超微粉的穿心蓮內(nèi)酯的溶出量約為普通粉的3～4倍，也是其他兩粉體的2倍左右。4種粉體以溶出濃度的自然對數(shù)對時間進行線性關(guān)系分析，得到 D50=3.16 μm，D50=30 μm，D50=50 μm，D50=150 μm的粉體的直線方程分別為:Y=0.393 6 LnX+2.891 2(r=0.958 6);Y=0.057 4 LnX+1.972 8(r=0.970 9);Y=0.085 4 LnX+1.669 7(r=0.927 7);Y=0.031 6 LnX+0.972 8(r=0.901 5)。

表3 4種粒徑粉體中脫水穿心蓮內(nèi)酯的溶出度(±s，n=3)

表3 4種粒徑粉體中脫水穿心蓮內(nèi)酯的溶出度(±s，n=3)

時間/min D50=3.16 μm/(μg/mL)D50=30 μm/(μg/mL)D50=50 μm/(μg/mL)D50=150 μm/(μg/mL)5 3.47±0.21 2.04±0.14 1.8±0.08 1.08±0.09 10 3.58±0.18 2.11±0.23 1.82±0.10 1.11±0.07 20 4.21±0.23 2.18±0.16 1.91±0.11 1.14±0.11 40 4.52±0.16 2.21±0.20 2.03±0.09 1.15±0.10 50 4.56±0.09 2.22±0.21 2.06±0.18 1.15±0.09 60 4.61±0.11 2.23±0.25 2.01±0.21 1.18±0.12 80 4.66±0.21 2.23±0.19 2.07±0.25 1.19±0.15 100 4.71±0.19 2.24±0.25 2.06±0.21 1.21±0.12 120 4.72±0.23 2.24±0.21 2.01±0.15 1.19±0.14 140 4.72±0.22 2.23±0.26 2.06±0.22 1.18±0.09 160 4.73±0.25 2.24±0.20 2.05±0.23 1.18±0.08

脫水穿心蓮內(nèi)酯的溶出度與時間的變化相關(guān)性良好，r在0.90～0.97之間，在限定的的溶出條件下，一定的粒度范圍內(nèi)，可以得到溶出速率和顆粒的關(guān)系，即粒徑的大小與溶出率的負相關(guān)關(guān)系。故當達到一定的粒徑時，粉體細胞組織發(fā)生改變，有效成分呈充分釋放狀態(tài)，可快速在溶劑中溶出，隨后受表面效應(yīng)的影響，溶出量略減少，溶出速率變慢。

3 討論

中藥的療效與其有效成分的溶出量密切相關(guān)，提高藥材中有效成分的溶出量，則可提高臨床療效［6］。本實驗采用高效液相法對穿心蓮藥材超微粉及普通粉進行溶出特性測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)穿心蓮藥材超微粉碎后，穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯的溶出率顯著增加，說明超微粉碎技術(shù)可明顯增加藥材化學(xué)成分的溶出量。利用線性回歸方法對實驗數(shù)據(jù)進行分析，建立了溶出動力學(xué)模型，對實驗值予以驗證，探討了中藥超細粉體有效成分溶出特性。實驗發(fā)現(xiàn)，當穿心蓮粉的顆粒d50＜30 μm時，溶出量的對數(shù)值對溶出時間呈良好的線性關(guān)系，溶出過程符合一級動力學(xué)模型，與實驗數(shù)據(jù)擬合得較好;但顆粒細化到d50為3.16 μm時，顯微特征實驗表明，細胞組織發(fā)生明顯改變，細胞破壁，基本無完整細胞存在，其有效成分溶出特性有明顯改變，表現(xiàn)出了溶出速率加快，在一定時間內(nèi)的溶出量突然增大，釋放較完全。研究表明，中藥經(jīng)超微細粉碎到一定程度后，可以大大提高中藥有效成分的溶出量和溶出速率，從而增加藥效，顯示了超微細粉碎技術(shù)作為一項高新技術(shù)在中藥加工中特有的優(yōu)勢［7］。

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