楊 健，張金霖，王清友，唐瑞文，王 俊，凌壽軍

（1.廣東煙草清遠(yuǎn)市有限公司連州市分公司，廣東 連州 513400；2.廣東煙草清遠(yuǎn)市有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511515）

煙草病毒病是全世界煙草栽培地區(qū)發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重的重要病害之一。近年來，煙草病毒病在我國(guó)各煙葉主產(chǎn)區(qū)有日趨加重的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)，已成為我國(guó)優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的重要制約因素。煙草病毒病的病原種類多樣，國(guó)外已從煙草上分離到病毒32種，國(guó)內(nèi)報(bào)道發(fā)現(xiàn)18種[1]。其中，危害最為嚴(yán)重的病原種類主要有煙草普通花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）、馬鈴薯 Y 病毒（Potato Virus Y，PVY）、煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV）等。田間調(diào)查顯示，當(dāng)前煙草病毒病多混合發(fā)生，病害流行年份造成的損失可達(dá)30%～50%，早期發(fā)病的可達(dá)50%～70%，個(gè)別田塊甚至絕收，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在生產(chǎn)上，我國(guó)目前依舊缺乏煙草病毒病的廣譜高抗品種，抗源遺傳基礎(chǔ)狹窄以及品種結(jié)構(gòu)單一。這不僅是近年來病毒病日趨嚴(yán)重的重要原因，還帶來病害大面積流行爆發(fā)的潛在危險(xiǎn)。因此，如何篩選和創(chuàng)新優(yōu)質(zhì)抗性種質(zhì)資源，培育優(yōu)良抗病品種，從根本上防治煙草病毒病已顯得尤為重要。本文從煙草病毒病抗性種質(zhì)資源的鑒定與培育，及其在煙草病毒病防治中的應(yīng)用研究等方面進(jìn)行了綜述，以期為煙草病毒病多抗品種的選育提供參考。

1 煙草病毒病抗性種質(zhì)資源鑒定現(xiàn)狀

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國(guó)家煙草種質(zhì)庫(kù)現(xiàn)已收集保存煙草野生種35份，烤煙品種1 104份，晾曬煙1 978份，白肋煙61份，黃花煙326份，以及雪茄煙3份[2]，其中不乏對(duì)煙草病毒病具有優(yōu)良抗性的品種。如何在眾多的種質(zhì)資源中篩選鑒定出對(duì)病毒病具有廣譜高抗的材料，并用于抗病育種，是解決當(dāng)前生產(chǎn)上主栽品種抗性基因單一所急需的手段。

近年來，我國(guó)煙草種質(zhì)資源相關(guān)研究已取得了一定的進(jìn)展，主要集中在煙草種質(zhì)資源的收集、保存、分類鑒定[3－4]、遺傳多樣性分析[5]以及種質(zhì)創(chuàng)新上[6－7]。其中，煙草病毒病抗性種質(zhì)資源鑒定研究也有一定數(shù)量的報(bào)道。Gupton最初報(bào)道了一個(gè)栽培種Virgin突變體Virgin A Mutant（VAM）對(duì)PVY具有良好抗性[8]；陳榮平等[9]通過病圃發(fā)病情況調(diào)查和溫室接種鑒定，篩選到3份抗PVY材料，其中CV91在田間接種和溫室接種后都表現(xiàn)為高抗病性，可以作為很好的育種材料；另外，在2009年，陳榮平等[10]采用相同方法，對(duì)69份煙草種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，初步鑒定出C151、Hawana10、壩林曬煙和Criollo salteno 11等11份表現(xiàn)為高抗PVY的煙草種質(zhì)；而TN86、V.SCR、筑波2號(hào)也被報(bào)道是優(yōu)良的PVY抗源材料[6－11]。這些結(jié)果都表明，在已有的煙草種質(zhì)中存在一定數(shù)量的PVY抗性種質(zhì)資源，它們作為PVY抗性供體在PVY抗病改良中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。盡管如此，由于鑒定病原單一，沒有獲得這些種質(zhì)其它病毒病的抗性指數(shù)信息，在病毒病多抗育種中依然存在一定的局限性。對(duì)此，戴培剛等選擇了1 000余份有代表性的煙草種質(zhì)，對(duì)包括TMV、CMV、PVY等7個(gè)主要病害的抗性進(jìn)行了鑒定分析[12]。在黃淮煙區(qū)供試品種中，TMV抗性資源較為豐富，高抗及免疫材料所占比例達(dá)到17.19%，中抗品種占18.76%；而CMV抗性種質(zhì)缺乏，無高抗及免疫品種，中抗種質(zhì)占20.70%，并主要分布在東北及西南煙區(qū)；另外，在41份烤煙品種中，鑒定的PVY抗性品種占14.63%，中抗比例為24.39%。在另一項(xiàng)研究中，劉艷華[4-5]等對(duì)202份煙草種質(zhì)同樣進(jìn)行了TMV、CMV、PVY3種病毒病的抗性鑒定，分別獲得抗TMV材料22份，抗CMV材料4份，以及抗PVY材料3份。這些研究結(jié)果為深入挖掘病毒病多抗種質(zhì)提供了較為系統(tǒng)及全面的數(shù)據(jù)參考，同時(shí)也為煙草病毒病抗病品種培育奠定了基礎(chǔ)。

表1統(tǒng)計(jì)了部分種質(zhì)資源對(duì)TMV、CMV、PVY的抗性情況。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看到，所有供試煙草種質(zhì)中，對(duì)2個(gè)及以上病毒表現(xiàn)為抗性的品種很少，僅為10個(gè)；而對(duì)3種病毒都具備抗性的品種只有陽(yáng)高小蘭花1個(gè)品種，且其對(duì)CMV及PVY只表現(xiàn)中等抗性。這些結(jié)果表明，一方面煙草病毒病廣譜抗性種質(zhì)資源的相對(duì)缺乏，另一方面我國(guó)病毒病廣譜抗性種質(zhì)的鑒定研究需要進(jìn)一步深入，尤其是要加強(qiáng)對(duì)野生種及農(nóng)家種的抗源挖掘。這些種質(zhì)經(jīng)長(zhǎng)期自然進(jìn)化及馴化后，往往具有較強(qiáng)的抗病、抗蟲及抗逆性狀，是廣譜抗病基因的天然寶庫(kù)，也是煙草多抗育種的重要基礎(chǔ)。

2 煙草病毒病抗性種質(zhì)資源創(chuàng)新現(xiàn)狀

2.1 物理化學(xué)誘變的應(yīng)用

在早期研究中，具有Virgin遺傳背景的VAM就是通過X-射線誘變得到的PVY高抗材料[8]，而VAM在抗PVY育種中也得到了實(shí)際應(yīng)用。Gooding[13]等以VAM及Cokeer86為親本育成了PVY抗性品種NC744，并用于商業(yè)推廣。我國(guó)煙草誘變育種也已起步，相關(guān)研究人員對(duì)經(jīng)太空誘變的13個(gè)烤煙品種進(jìn)行篩選，獲得了一系列突變材料，后期研究發(fā)現(xiàn)突變體后代的整體抗病性得到了顯著提高[14]。另外，離子注入技術(shù)等誘變方法在煙草種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用也已見所報(bào)道[15]，這些突變體極大地豐富了我國(guó)煙草種質(zhì)資源，在種質(zhì)創(chuàng)新及誘變育種中具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 細(xì)胞工程的應(yīng)用

煙草野生種與栽培種往往存在種間不親合現(xiàn)象，利用傳統(tǒng)育種方法很難實(shí)現(xiàn)野生種優(yōu)良性狀向栽培種的轉(zhuǎn)移。而細(xì)胞工程是克服種間不親合障礙、解決性狀轉(zhuǎn)移困難的有效手段，其中以體細(xì)胞雜交在煙草種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用最多。目前，我國(guó)利用體細(xì)胞雜交技術(shù)創(chuàng)新煙草種質(zhì)已取得相當(dāng)進(jìn)展。自70年代以來，我國(guó)先后成功誘導(dǎo)出普通煙草與8個(gè)野生煙草中的種間體細(xì)胞雜種。其中，普通煙草栽培品系86-1和N.nesophila的體細(xì)胞雜種株系，在接種TMV及CMV后表現(xiàn)枯斑反應(yīng)，具備良好的病毒病抗性[16]；另外，孫學(xué)永等用G140與抗花葉病的野生波葉煙草N.undalate進(jìn)行體細(xì)胞雜交，也得到了優(yōu)良TMV抗性的體細(xì)胞雜交單株自交系[17]。除此之外，利用組織培養(yǎng)中高頻率的細(xì)胞變異現(xiàn)象，篩選煙草抗性材料也有相關(guān)報(bào)道[18]。通過細(xì)胞工程手段，獲得的煙草抗性材料，不僅是煙草種質(zhì)資源的重要來源，而且更多的是這些育種中間體作為新的煙草抗性種質(zhì)資源在改良煙草病毒病抗性性狀上具有巨大的應(yīng)用潛力。

2.3 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用

自1986年P(guān)owell Abel將TMV外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草獲得第一例轉(zhuǎn)基因抗病毒植株以來[19]，利用現(xiàn)代生物技術(shù)獲得病毒病抗性植株，已成為煙草抗病種質(zhì)資源創(chuàng)新的重要技術(shù)策略。我國(guó)利用生物技術(shù)培育抗病毒煙草起步較早，在90年代中期，我國(guó)科研人員就利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別培育出CMV、

PVY抗性煙草植株[20－21]。之后，朱俊華等利用RNA沉默技術(shù)獲得RNA介導(dǎo)的PVY抗性煙草[22]；與之類似，顏培強(qiáng)等應(yīng)用RNAi技術(shù)培育出高抗TMV的轉(zhuǎn)基因煙草植株[7]；進(jìn)一步的研究利用RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，將一融合基因轉(zhuǎn)入受體，獲得了抗多種病毒病的轉(zhuǎn)基因煙草，研究結(jié)果顯示T1代轉(zhuǎn)基因植株兼具TMV、CMV、PVY的抗性，并且抗性性狀遺傳穩(wěn)定[23]。這些研究表明，轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅能突破自然界原本的種間隔閡，將其他物種的優(yōu)良病毒病抗病基因引入煙草種屬，重要的還是將其作為創(chuàng)新煙草病毒病抗性種質(zhì)的有效手段，尤其在煙草種質(zhì)庫(kù)中病毒病廣譜抗源普遍缺乏的情況下，利用多基因融合轉(zhuǎn)化技術(shù)能夠創(chuàng)造出新的多抗煙草材料，為煙草病毒病多抗育種提供更為多樣的材料選擇。

表1 部分煙草種質(zhì)的主要病毒病抗性

3 前景與展望

培育煙草病毒病廣譜抗性品種是防治煙草病毒病流行，降低病害經(jīng)濟(jì)損失的根本手段，而煙草病毒病抗性種質(zhì)的鑒定與創(chuàng)新是多抗育種的重要基礎(chǔ)。目前，盡管我國(guó)相關(guān)抗性鑒定研究取得一定進(jìn)展，但所篩選到的病毒病抗性種質(zhì)依舊較少，尤其是所鑒定的廣譜抗性種質(zhì)極其缺乏，在生產(chǎn)上直接表現(xiàn)為抗病毒育種對(duì)病毒病防治的貢獻(xiàn)率較低。究其根源，這與對(duì)現(xiàn)有種質(zhì)資源的挖掘和利用不夠有很大關(guān)系。因此，在今后一段時(shí)間內(nèi)，煙草病毒病抗性種質(zhì)資源鑒定與創(chuàng)新研究應(yīng)加強(qiáng)以下幾個(gè)方面：（1）充分利用我國(guó)豐富的煙草種質(zhì)資源，擴(kuò)大篩選范圍，尤其注重?zé)煵菀吧N及農(nóng)家種的抗性評(píng)價(jià)，鑒定出更多的廣譜抗性種質(zhì)，并對(duì)部分重點(diǎn)種質(zhì)做到精準(zhǔn)鑒定，篩選出多抗育種的骨干親本；（2）利用現(xiàn)代生物技術(shù)，充分發(fā)揮分子標(biāo)記等手段在種質(zhì)遺傳多樣性、抗性鑒定以及優(yōu)質(zhì)基因挖掘上的優(yōu)勢(shì)，不斷提高病毒病抗性鑒定效率；（3）加大煙草病毒病抗性種質(zhì)創(chuàng)新力度，充分發(fā)揮細(xì)胞工程及轉(zhuǎn)基因技術(shù)在克服種間障礙中的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良抗病性狀的轉(zhuǎn)移，不斷豐富病毒病抗性遺傳基礎(chǔ)；（4）注重現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種的結(jié)合，提高育種效率，加快優(yōu)良抗性性狀的應(yīng)用步伐。

[1]李 凡，陳海如.引起煙草病害的病毒種類研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，16（2）：160-166.

[2]任 民，王志德，牟建民，等.我國(guó)煙草種質(zhì)資源的種類與分布概況[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2009，30（增刊）：8-14。

[3]李文平，朱列書，趙松義.煙草種質(zhì)資源部分性狀的相關(guān)、通徑及聚類分析[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2009，30（增刊）：59-63.

[4]劉艷華，王志德，錢玉梅，等.煙草抗病毒病種質(zhì)資源的鑒定與評(píng)價(jià)[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2007，28（5）：1-4.

[5]劉建豐，王志德，劉艷華，等.應(yīng)用SRAP標(biāo)記研究煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2007，28（5）：49-53.

[6]劉鳳蘭，段旺軍，王素琴，等.離子注入技術(shù)及其在煙草育種上的應(yīng)用研究[J].種子，2004，23（12）：58-60.

[7]顏培強(qiáng)，白先權(quán)，萬(wàn)秀清，等.應(yīng)用RNAi技術(shù)培育抗TMV病毒轉(zhuǎn)基因煙草[J].遺傳，2007，29（8）：11018-1022.

[8]Gupton C L,Burk L G.Location of the factor for resistance to potato virus Y in tobacco[J].Heredity,1973，64：289-290.

[9]陳榮平，馮春才.煙草抗PVY育種材料的篩選與應(yīng)用[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2000，21（1）：1-4.

[10]陳榮平，馮春才，王春軍，等.部分煙草種質(zhì)資源的PVY抗性鑒定[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2009，30（增刊）：56-58.

[11]周顯升，錢玉梅，陳德鑫，等.煙草品種對(duì)馬鈴薯Y病毒抗性遺傳分析[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，1997，13（1）：31-36。

[12]戴培剛，王志德，牟建民，等.部分煙草種質(zhì)主要病害抗性分析[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2004（3）：1-5.

[13]Gooding G V,Kennedy G G.Resistance in tobacco breeding line NC744 to potato virus Y and inoculation by aphids[J].Plant Disease,1985,69：396-397.

[14]董志堅(jiān)，董順德，趙獻(xiàn)章，等.空間誘變育種技術(shù)及其在煙草上的研究前景[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2005，11（2）：35-39.

[15]孫 煥，劉鳳蘭，王素琴.烤煙雄性不育雜交種制種技術(shù)[J].中國(guó)種業(yè)，2006，（11）：12-15.

[16]孫玉合，丁昌敏，張歷歷，等.煙草種間體細(xì)胞雜交及其在育種上的應(yīng)用[J].中國(guó)煙草科學(xué)，1998（4）：5-8。

[17]孫學(xué)永，林國(guó)平，殷鳳生，等.煙草體細(xì)胞雜交優(yōu)質(zhì)抗病株系的選育[J].煙草科技，2003（7）：36-40.

[18]彭劍濤，向 結(jié).利用組織培養(yǎng)技術(shù)獲得煙草抗性材料的研究[J].種子，2002，（3）：26-27.

[19]Powell A P,Nelson R S,De B,et al.Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene[J].Science,1986,232:738-743.

[20]吳中心，張同慶，姚根懷，等.快速選育抗黃瓜花葉病毒的轉(zhuǎn)基因煙草純合品系[J].中國(guó)煙草，1994，（3）：1-7。

[21]王振東，劉玉東.馬鈴薯Y病毒復(fù)制酶基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的培育 [J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，26（3）：249-253.

[22]朱俊華，朱常香，溫孚江，等.正向和反向重復(fù)RNA介導(dǎo)的抗馬鈴薯Y病毒基因工程比較研究 [J].植物病理學(xué)報(bào)，2004，34（2）：133-140.

[23]朱常香，宋云枝，溫孚江.多抗PVY、TMV和CMV轉(zhuǎn)基因煙草的培育[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（4）：1040-1047.