于玉鳳 ，陸兆新 ，盧亞萍 ， ，劉茜茜 ，陳舟舟

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3）是一類(lèi)重要的甘油酯鍵水解酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物各種組織及微生物中，可以在油水界面上催化脂類(lèi)物質(zhì)分解、合成和酯交換反應(yīng)，是最早研究的酶類(lèi)之一[1]。微生物脂肪酶具有種類(lèi)多，比動(dòng)物脂肪酶更廣的作用pH值和作用溫度范圍，便于進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)和獲取高純度制劑等優(yōu)點(diǎn)，在食品、制革、飼料等多個(gè)行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[2-3]。不同種屬的微生物所產(chǎn)生的脂肪酶具有不同的催化特性，發(fā)現(xiàn)具有不同催化特性（如耐高溫、耐低溫、耐有機(jī)溶劑等）的脂肪酶產(chǎn)生菌以滿(mǎn)足不同的工業(yè)生產(chǎn)需求具有重要意義。從自然界中尋找產(chǎn)生優(yōu)良特性的脂肪酶的菌株，是促進(jìn)脂肪酶研究與應(yīng)用的有效途徑之一。筆者從油菜地土壤中分離到一株高效產(chǎn)脂肪酶菌株C1，對(duì)其進(jìn)行了菌種鑒定，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，旨在為脂肪酶工程菌株的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣本實(shí)驗(yàn)所用土壤樣品采自江蘇農(nóng)科院多年種植油菜的試驗(yàn)田。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：酵母抽提物2 g/L，橄欖油 5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO40.1 g/L，（NH4）2SO41 g/L，NaCl 0.5 g/L，自然 pH；初篩培養(yǎng)基：乳化橄欖油 10 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO40.1 g/L，（NH4）2SO41 g/L，KCl 0.5 g/L，Agar 15 g/L，自然 pH；羅丹明 B復(fù)篩培養(yǎng)基：LB平板中添加0.001%羅丹明B和1%乳化橄欖油；產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g/L，酵母抽提物5 g/L，K2HPO42 g/L，橄欖油10 g/L，MgSO40.5 g/L，自然 pH。

1.2 方法

1.2.1 菌種的篩選 稱(chēng)取5 g土壤置于45 mL生理鹽水中，加玻璃珠打散。移取5 mL至45 mL富集培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2～4 d。梯度稀釋富集培養(yǎng)液，涂布到以橄欖油為唯一碳源的初篩平板上，37℃培養(yǎng)2～4 d。從初篩平板上挑取有水解圈的菌落，用無(wú)菌牙簽接種到羅丹明B復(fù)篩平板上，7℃培養(yǎng)2～4 d。觀察并測(cè)量菌落周?chē)鸁晒馊Φ拇笮　＿x取熒光圈直徑/菌落直徑較大的菌落，劃線分離后接種到LB中過(guò)夜培養(yǎng)，種子液加入產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)，24 h后每隔6 h取樣測(cè)酶活。

1.2.2 菌種的鑒定 根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)篩選的菌體進(jìn)行表型和生理生化的鑒定。并以C1基因組DNA為模板，16S-F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和 16S-R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增其16Sr RNA的編碼基因，測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.3 酶活性的測(cè)定 參照Lee et al.的脂肪酶活測(cè)定方法[4]，略作修改。取10μL發(fā)酵上清液，100 μL 10 mM pNPB（對(duì)硝基苯丁酯）加入到2.89 mL PBS（pH 7.4）中，37℃進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚在410nm處的吸光值。以已知濃度（0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 μmol）的對(duì)硝基苯酚作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶活。每分鐘產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚所需的脂肪酶定義為1個(gè)酶活單位。

（1）酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性測(cè)定：分別于35～80℃溫度下測(cè)定去除菌體的上清發(fā)酵液中脂肪酶活力，以測(cè)定脂肪酶最適反應(yīng)溫度。將酶液分別于40～80℃溫度冰浴中保溫1 h和5 h，立即取出冷卻后測(cè)定其酶活。

（2）酶的最適pH值和pH穩(wěn)定性測(cè)定：配制不同pH值的0.5 mmol/L緩沖液，包括PBS緩沖液（pH 5.0～8.0），Gly－NaOH 緩沖液（pH 9.0～12.0）。在37℃下對(duì)不同pH值的緩沖液測(cè)定酶活力，測(cè)定酶的最適pH。將酶在37℃，pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 的緩沖液中（1∶1/v/v）保溫 1 h 和5 h，然后在 37℃，pH 7.4，0.5 mmol/L PBS 緩沖液中測(cè)定殘余酶活力，檢測(cè)酶的pH穩(wěn)定性。

（3）酶的有機(jī)耐性測(cè)定：選取極性不同的有機(jī)溶劑，分別取各種有機(jī)溶劑25μL與75μL的酶液充分混合后，放在37℃下保溫，處理0.5、4.5、11.5 h后測(cè)定其殘余酶活。以加入相同體積的蒸餾水為對(duì)照，并定義為100%酶活。

1.2.4 酶的金屬離子耐性測(cè)定 選取常見(jiàn)的金屬離子，將0.1 mol/L相對(duì)應(yīng)的金屬離子10μL與90 μL酶液充分混合后，放入37℃條件下保溫1 h，測(cè)定其殘余酶活。同樣以加入相同體積的蒸餾水為對(duì)照，并定義為100%酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株的篩選與生理生化特性鑒定 通過(guò)多輪初篩和復(fù)篩，得到40株產(chǎn)脂肪酶的細(xì)菌。從羅丹明B復(fù)篩平板上挑取有明顯水解圈的菌落（見(jiàn)圖1），接種到基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在培養(yǎng)至72 h時(shí)，其中的一株產(chǎn)酶量最高，酶活可達(dá)到28.5 U/mL，命名為C1。C1菌落呈白色，表面光滑不透明，突起，易挑起，有淡淡的異味，結(jié)合其生理生化特性（見(jiàn)表1），初步鑒定C1為Burkholderia cepacia。

表1 菌株C1的生理生化特性

2.1.2 16Sr DNA序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的建立經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，菌株C1的16Sr DNA序列為2 084 bp，將所得序列在NCBI網(wǎng)頁(yè)上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C1的16Sr DNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中Burkholderia cepacia strain S31 LipA（lipA）和 LipB（lipB）（FJ638612.1）比較接近，相似性達(dá)99%。從BLAST比對(duì)的結(jié)果中選取來(lái)源不同的序列，利用軟件MEGA4.1繪制進(jìn)化樹(shù)，從圖2可以看出，進(jìn)化樹(shù)中菌株C1與菌株Burkholderia cepacia（FJ638612.1）位于同一分支，親緣關(guān)系最近。根據(jù)菌株C1的形態(tài)特征、生理生化特征和16Sr DNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建，鑒定菌株 C1為 Burkholderia cepacia。

2.2 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性 如圖3所示，酶在65℃時(shí)達(dá)到最高酶活力，即酶的最適溫度為65℃。

如圖4所示，處理1 h后，其酶活下降較少，其中70℃下仍殘留酶活91.2%；處理5 h后，60℃下殘留酶活76.2%，隨后酶活大幅下降，可見(jiàn)酶的耐溫性較好。

2.2.2 酶的最適pH值和pH穩(wěn)定性 由于在pH值9.0～11.0條件下，底物分解非常迅速，使得測(cè)定數(shù)據(jù)嚴(yán)重失真。因此，圖5中只反映pH值5.0～8.0條件對(duì)脂肪酶活力的影響，其中在pH值8.0時(shí)，酶活最高，比pH值7.4時(shí)酶活多出41.8%，酶的最適pH值為8.0。

由圖6可知，脂肪酶在pH值8時(shí)穩(wěn)定性最高，在pH值5～10范圍內(nèi)溫育1 h，酶活殘留量均保持在80.0%以上，只在pH值>10以后，酶活大幅下降，只殘留32.9%；溫育5 h后，在pH值9處仍然殘留59.8%的酶活，說(shuō)明酶具有較穩(wěn)定的pH耐性。

2.2.3 酶的有機(jī)耐性 如圖7所示，酶對(duì)正己烷、乙醇、甲醇耐性最好，對(duì)乙酸乙酯、甲苯和異丙醇耐性較好，而對(duì)苯酚、乙腈和乙酸耐性較差。

2.2.4 酶的金屬離子耐性 如圖8所示，K+、Mg2+對(duì)脂肪酶活性有明顯促進(jìn)作用；Na+、Mn2+、Zn2+和 Fe3+對(duì)脂肪酶活性有微弱的抑制作用，殘留酶活保持在80.0%以上；而Ca2+和Cu2+對(duì)脂肪酶活性有嚴(yán)重抑制作用，殘留酶活在35.0%以下。

3 結(jié)論

圖8 金屬離子對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響

本研究從土壤中篩選得到了一株高效產(chǎn)脂肪酶的菌株C1，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征和16Sr DNA序列分析鑒定為Burkholderia cepacia。對(duì)其所產(chǎn)脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，酶的最適溫度為65℃，最適pH值為8.0。酶的溫度耐性較好，70℃下溫育1 h殘留酶活91.2%，60℃ 下溫育5 h殘留酶活76.2%；酶的pH耐性?xún)?yōu)良，在pH值5.0～10.0范圍內(nèi)處理1 h，酶活殘留量均保持在80.0%以上，在pH值5.0～9.0范圍內(nèi)處理5 h，酶活殘留量均在59.8%以上；酶對(duì)正己烷、乙醇、甲醇具優(yōu)良的耐性，對(duì)乙酸乙酯、甲苯和異丙醇耐性較好，而對(duì)苯酚、乙腈和乙酸耐性較差；K+、Mg2+對(duì)脂肪酶活性有明顯促進(jìn)作用，Na+、Mn2+、Zn2+和 Fe3+對(duì)脂肪酶活性有微弱的抑制作用，而Ca2+和Cu2+對(duì)脂肪酶活性有嚴(yán)重抑制作用。與吳繼光[5]、趙春雷[6]等的研究相比，該脂肪酶的溫度耐性明顯較強(qiáng)，且經(jīng)過(guò)對(duì)其發(fā)酵條件的優(yōu)化，其產(chǎn)酶活性可大幅提高，此脂肪酶具有較大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

[1]Jaeger K E，Eggert T.Lipases for biotechnology[J].Current Opinion in Biotechnology，2002，13（4）：390-397.

[2]劉海洲，劉均洪，張媛媛，等.微生物脂肪酶的最新應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，30（1）：141-143.

[3]GUPTA R，GUPTA N，RATHI P.Bacterial lipases：an overview of production，purification and biochemical properties [J].Applied Microbiology and Biotechnology，2004，64：763-781.

[4]Lee D W，Koh Y S，Kim K J，et al.Isolation and characterization of a thermophilic lipase from Bacillus thermoleovorans ID-1[J].FEMSMicrobiology Letters，1999，179：393-400.

[5]吳繼光，舒正玉，程藍(lán)骍，等.耐受有機(jī)溶劑洋蔥伯克霍爾德菌ZYB002全細(xì)胞脂肪酶酶學(xué)性質(zhì) [J].微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（1）：2-6.

[6]趙春雷，閆麗娟，謝振榮，等.一株耐熱脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010，（2）：185-188.