丁茁荑,鄭明福,楊博智,吳藝飛,周曉波
(湖南省蔬菜研究所,湖南省蔬菜工程技術研究中心,湖南 長沙 410125)
栝蔞又名瓜蔞、藥瓜等,為多年生草質藤本的葫蘆科栝蔞屬植物,目前主要利用的有栝蔞(Trichosanthes rosthornii Kirilowii Maxim)及雙邊栝蔞(Trichosanthes rosthornii Harms)。栝蔞的根、籽(果仁)、皮(果皮)均可入藥,具有清涼解熱、止咳、消腫、治療糖尿病等多種疾病的功效[1]。近年來,因發(fā)現(xiàn)栝蔞籽具有獨特的風味和保健作用,被作為一種高檔食用瓜子開發(fā)進入市場,使得栽培面積急劇增長。
近年來栝蔞在湘南也具有一定的種植規(guī)模,并取得了較好的經濟效益。農民及栝蔞加工企業(yè)對發(fā)展栝蔞產業(yè)積極性很高,但因種苗問題,嚴重制約了生產的發(fā)展。由于栝蔞種子發(fā)芽率低且雌雄異株,種子繁育的苗中只有約30%為可用的雌株,且要在開花后才能辨別,費時費力。同時種子繁殖也易導致品種分離,故主要采取分株無性繁殖的方法,但該法繁殖速度慢,容易導致品種退化和加快病害的傳播。
為解決生產中的這一問題,研究組自2005年開始對栝蔞種苗的快繁技術進行了較為全面的研究,建立了其莖尖培養(yǎng)快繁技術體系,有效地解決了這一難題。現(xiàn)繁殖的栝蔞幼苗性狀整齊一致,雌株率100%,種苗無病無毒,生活力明顯優(yōu)于分根繁殖苗,已大規(guī)模應用于生產。
本次試驗樣品取自湖南省蔬菜研究所試驗田,從中選擇人工接種并明顯感染黃瓜花葉病毒的植株,剪取其分枝前端。
1.2.1 外植體消毒與處理 (1)預處理:將采回的栝蔞嫩枝條,留腋芽及頂芽,截成2~3 cm長的莖段,先用自來水沖洗2~3次,再用蒸餾水沖洗1次,待用。(2)消毒:70%的乙醇滅菌30 s,3%的次氯酸鈉溶液滅菌15 min,無菌水沖洗3~4次。切去切口端少許。(3)預培養(yǎng):將上述消毒處理好的外植材料接種于MS+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)基中,約15 d后,腋芽或頂芽生長,形成小苗,備用。
1.2.2 莖尖剝取與培養(yǎng) 切取上述小苗莖尖,在解剖鏡下用解剖針剝取其分別為0.2、0.5、0.8 mm莖尖各50個以上,接種在不添加激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后,轉到MS+2.0 mg 6-BA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。每瓶2~3個,光照強度為3 000 Lx,光照時間為每天 10 h,溫度為(28±2)℃。
1.2.3 黃瓜花葉病毒檢測 采用王麗花等所述RT—PCR 法[2]。
1.2.4 愈傷組織誘導及增殖培養(yǎng)基的篩選 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,添加3%白糖(市售)、0.7%瓊脂和不同激素濃度配比,pH 5.8(表1)。
表1 誘導愈傷組織培養(yǎng)基不同激素配比 (mg/L)
以0.5 cm長莖切段作為外植體接種于上述培養(yǎng)基上,在28℃、光照強度3 000 Lx、光照時間每天12 h的條件下進行愈傷組織誘導培養(yǎng)。
1.2.5 叢生芽誘導培養(yǎng)基的篩選 將帶有芽點的愈傷組織分割成邊長為0.5 cm的小塊,分別接種到叢生芽誘導培養(yǎng)基上。叢生芽誘導培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基,添加3%白糖及0.7%瓊脂以及不同濃度NAA和6-BA,pH 5.8(表2)。每處理接種愈傷組織25瓶,每瓶4塊,培養(yǎng)條件為20℃(夜)~28℃(日)、光照強度3 000 Lx、光照時間每天12 h。觀察叢芽發(fā)生和生長情況。
表2 叢生芽誘導培養(yǎng)基不同激素配比 (mg/L)
1.2.6 繼代培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)出的芽取出,按節(jié)切下,接種于繼代培養(yǎng)基中,獲得發(fā)育健壯的栝蔞無根苗。 繼代培養(yǎng)基設計了兩種配方:MS+6-BA 2.0 mg/L 和 MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L,培養(yǎng)條件同上。
1.2.7 生根培養(yǎng)基的篩選 以1/MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,3%白糖(市售)、0.7%瓊脂,pH 5.8,分別添加0.2、0.4、0.6 mg/L NAA不同激素濃度配比,對照中不加任何激素。每種激素濃度配25瓶培養(yǎng)基。
將繼代培養(yǎng)苗按3~4節(jié)長切下,接入以上生根培養(yǎng)基中,每處理接種25瓶,每瓶接種苗切斷4個,培養(yǎng)條件為18℃(夜)~28℃(日)、光照強度3 000 Lx、光照時間每天12 h。觀察統(tǒng)計根的發(fā)生和生長情況。
1.2.8 試管苗移栽 15~20 d生根培養(yǎng)后,去培養(yǎng)瓶蓋,在室內煉苗2~3 d后,沖洗掉根系上的培養(yǎng)基,移栽至塑料大棚珍珠巖基質中。溫度保持23~28℃,白天采用自控微噴系統(tǒng)噴霧保濕,晴天每1~1.5 h噴霧5 min,陰雨天每2~4 h噴霧4 min,3 d后噴霧次數(shù)減半,一周后,隨著幼苗新根發(fā)生,逐步停止噴霧,期間每天噴營養(yǎng)液5 min(1/2園試無土栽培配方)。
1.2.9 栝蔞的扦插 試驗用插穗有兩種:一種取自移栽組培苗,另一種取自大田兩年生植株,分別剪取有2~3葉的莖尖或側枝作為插穗。用0.2%生根粉浸泡插穗,處理時間分別設為:0(不泡生根劑直接扦插)、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。
將上述處理過的插穗(每處理200個)分別扦插于珍珠巖基質苗床上,管理方式同試管苗移栽。10 d后觀察新根發(fā)生情況,每處理隨機取樣10株測量生根數(shù),取平均值。
1.2.10 育苗大田定植 移栽的試管苗或扦插苗根系發(fā)育良好后,停止肥水5 d左右煉苗,選擇陰天或晴天傍晚,帶根定植于大田,密度約4 000株/667m2。
接種于不添加激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后,莖尖大多生成愈傷組織,轉到MS+2.0 mg 6-BA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30 d左右后,生長出小苗,其中部分生根。統(tǒng)計其成苗率和取其葉片檢測CMV,結果見表3。其中成苗率=(成苗數(shù)/接種數(shù))×100%,脫毒率=(1-CMV 檢出數(shù)/成苗數(shù))×100%。
表3 不同莖尖大小成苗率和CMV檢出率
從表3中可以看出,不同莖尖大小的成苗率和病毒檢出率差異很大,莖尖越小,成苗率越低,但脫毒效果越好。其中0.8 mm大小的莖尖成苗最為容易,成苗率高達83.7%,但幾乎不能脫除病毒,其中只有一株未能檢出CMV,脫毒率僅為1.4%。0.5 mm的莖尖成苗率為34.8%,脫毒效果較為明顯,達到了29.2%(見圖1)。而0.2 mm的莖尖成苗率雖然很低,只有13.7%,但脫毒效果最好,沒有檢出CMV,脫毒率達到100%。
圖1 部分0.5 mm莖尖培養(yǎng)植株CMV RT-PCR檢測
為防止連續(xù)無性繁殖可能導致的病毒積累而退化的問題,對栝蔞進行脫毒培養(yǎng)是必要的。但栝蔞的主要病毒種類不是很清楚,本試驗以大田中感染較為普遍的黃瓜花葉病毒作為標志性病毒,人工接種后,通過檢測莖尖培養(yǎng)對黃瓜花葉病毒的脫除效果,來評價整體脫毒效果。莖尖培養(yǎng)脫毒的原因是小莖尖分生組織尚未形成微管束,病毒無法移動感染,因此,在一定大小的莖尖下CMV不能感染,以至其他病毒也不能感染,表明以CMV作為脫毒標志應該是可行的。也就是說,如果該方法能有效脫除黃瓜花葉病毒,那么同樣也能脫除其他病毒(如果存在的話)。據(jù)此可以認為,采用0.2 mm大小的莖尖培養(yǎng),能有效脫除栝蔞病毒,獲得無病毒苗。
栝蔞外植體接種在添加如表1所示不同濃度激素MS培養(yǎng)基上,培養(yǎng)約10 d時,所有培養(yǎng)基上的莖尖和莖切段基部均有淡黃色的愈傷組織形成。繼續(xù)培養(yǎng)約10 d,形成的愈傷組織開始分化出淡綠色芽點,但不同激素配比培養(yǎng)基培養(yǎng)的效果不同(見表 4)。
表4 不同培養(yǎng)基接種20 d后愈傷組織誘導效果
培養(yǎng)結果表明,添加適宜濃度的NAA有利于愈傷組織的形成,但添加0.5 mg/L與1.0 mg/L的6-BA效果并無明顯差異。觀察發(fā)現(xiàn),在添加0.4 mg/L和0.6 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上誘導形成的愈傷組織較大,色澤較淡而明亮,是較優(yōu)激素配比。而較高濃度的NAA則抑制愈傷組織的生長。
將栝蔞0.5 cm大小愈傷組織小塊接種到表2所示不同激素配比的MS培養(yǎng)基中,培養(yǎng)10 d后,絕大多數(shù)愈傷組織分化出3個左右小芽,各處理間差異不明顯。培養(yǎng)20 d后的叢生芽誘導情況見表5。結果表明,Ⅶ號激素配比培養(yǎng)基(6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)效果最佳,其誘導的叢芽數(shù)目相對較多,生長速度快,植株健壯,長勢良好(見圖2)。
圖2 叢生芽誘導效果
當培養(yǎng)基中6-BA濃度較低時,叢生芽生長速度較慢,節(jié)間較短;而濃度偏高時,腋芽發(fā)育,也抑制叢生芽的生長速度。較低濃度NAA(0.2 mg/L)也有促進叢生芽生長的效果,但濃度較高且6-BA濃度偏低時,愈傷組織生長并分化出根系,叢生芽生長緩慢,節(jié)間短縮。
表5 不同激素配比對栝蔞愈傷組織叢生芽的誘導效果
有研究表明,組織培養(yǎng)通過愈傷組織分化再誘導成苗,雖然繁殖系數(shù)高,但有變異退化的風險。特別是重復地進行誘導愈傷組織—分化—誘導—分化的過程,這種風險將顯著增加。
作為工廠化脫毒苗生產,繁殖代數(shù)高,為了避免變異退化的風險,選擇了利用葉芽增殖的方式,即類似于試管扦插,雖然繁殖系數(shù)較低,但加代時間較短,總體增殖速度與愈傷組織培養(yǎng)途徑基本相當。
兩種配方的繼代培養(yǎng)基都表現(xiàn)良好,之間沒有明顯差異。接種的莖節(jié)沒有產生大的愈傷組織,而葉芽都萌發(fā)生長,幼苗及葉芽健壯無畸變,生活力高(見圖3)。幼苗生長速度快,在第15天左右可生長2~3節(jié),即可按單節(jié)莖段分切繼代,完成一個繁殖周期。
圖3 MS+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)基繼代產生的腋芽
因為兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)效果無明顯差異,故選擇較為簡單的MS+6-BA 2.0 mg/L作為最適繼代培養(yǎng)基。
1/2 MS添加不同濃度NAA的培養(yǎng)基對栝蔞苗根系誘導效果見表6。
表6 不同激素濃度對栝蔞根系的誘導效果
由表6及圖3可知,將無根苗接種到1/2MS+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上,單株根分化較多,形成的白色根系較發(fā)達,生長旺盛,根毛多,愈傷組織小。隨NAA濃度的增加,生根率下降,且不定根根毛較少、不發(fā)達、根生長緩慢,短粗,脆而易斷,愈傷組織發(fā)達,根部分泌物增加。因此,添加0.2 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基是最適宜于誘導栝蔞試管苗生根的培養(yǎng)基。
另外,從不同大小外植體誘根效果觀察中發(fā)現(xiàn),當外植體幼苗小于3節(jié)時,會出現(xiàn)和高濃度NAA類似的誘導效果,即愈傷組織發(fā)達,根系短粗而脆,苗生長緩慢。因此,在進行誘根處理時,保證外植體大于3節(jié)是非常必要的。
試管生根苗移栽至塑料大棚珍珠巖中,成活率與苗的大小關系較大。據(jù)觀察,5節(jié)以上健壯植株,只要嚴格按要求操作,移栽成活率即可高達95%以上。3節(jié)以下的小苗成活率較低,在50%左右。特別注意的是移栽后前3~5 d,保持濕度是關鍵。
移栽的試管苗或扦插苗新根大量發(fā)生后,停止肥水5 d左右煉苗,選擇陰天或晴天傍晚,定植于大田,密度約4 000株/667m2。移栽后15 d左右,植株發(fā)生大量新根,并進入快速生長期,煉苗后,可選擇陰天或晴天傍晚定植于大田,觀察統(tǒng)計成活率在95%左右。
育苗大田定植在4~9月皆可進行,一般7月前定植者,需要控制肥水以避免藤蔓生長過旺。調查表明,肥水較好的田塊,種根反而較小,而未施肥灌水地塊,種根直徑基本在2.5 cm以上。8~9月后定植的田塊,則應保證肥水供應,種根直徑在2 cm左右。
于扦插后10 d,觀察插穗生根狀況,其結果見表7。
表7 不同插穗及處理方法對扦插生根率的影響
從表7可以看出,不同插穗來源扦插生根能力差異極為顯著,來源于組培苗的插穗生根率均高于80%,平均達91.8%,而來源于大田兩年生苗的插穗,生根率均低于12%。觀察發(fā)現(xiàn),該類插穗切口少有愈傷組織發(fā)生,易于褐化腐爛,可能是其木質化程度高,難以分化,且大田中植株病菌較多所致。
以0.2%生根粉浸泡組培苗插穗,不同浸泡時間對插穗根系發(fā)生亦有較為明顯的影響,其差異主要體現(xiàn)在根量和根系生長活力上,在生根率方面差異不大,基本在90%以上。其中處理1h的效果最好,生根率達到94.5%,根系最為發(fā)達,根量多而細長,根毛著生多,根系活力高。浸泡時間過長,發(fā)根量稍少,根系生長速率緩慢,根變粗,根毛減少。未用生根劑處理的空白對照(組培苗)生根率也能達到95%,只是根系比較短,根量比較少。
根據(jù)以上試驗結果,就栝蔞無毒苗組培快繁技術體系要點總結如下:
(1)無毒苗獲得。選優(yōu)良單株,取0.2 mm莖尖,于MS培養(yǎng)基(不添加激素)中培養(yǎng)45 d后,轉到MS+0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA的培養(yǎng)基中誘導愈傷組織。將愈傷組織分割成0.5 cm的小塊,接種到MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的MS叢生芽誘導培養(yǎng)基上,獲取大量無毒叢生芽。
(2)無毒苗試管苗繼代增殖。將叢生芽按節(jié)切段,以MS+6-BA 2.0 mg/L為培養(yǎng)基,通過葉芽進行重復繼代增殖。
(3)生根移栽。將3節(jié)以上的繼代增殖試管苗于1/2MS+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上誘導生根。小苗5節(jié)以上時,煉苗2~3 d后,移栽至珍珠巖基質中,溫度>15℃,微噴系統(tǒng)噴霧保濕,一周后,隨著幼苗新根發(fā)生,逐步停止噴霧,期間每天噴霧營養(yǎng)液5 min(1/2園試無土栽培配方)進行葉面施肥。
(4)扦插擴繁。剪取移栽組培苗帶有2~3葉的莖尖或側枝作為插穗,用0.2%生根粉浸泡插穗1 h,扦插于珍珠巖基質苗床上,管理方式同上。
(5)大田定植。扦插20 d左右后,選擇陰天或晴天傍晚,帶根定植于大田,密度(株行距)30 cm×30 cm。一般7月前定植者,需要控制肥水以避免藤蔓生長過旺,8~9月后定植的田塊,則應保證肥水供應。待12月地上部枯死后,挖出種根,陽光下曬2~3 d 后,室內儲存。
本研究的特點是用莖尖培養(yǎng)脫除病毒后,利用腋芽進行繼代增殖,盡可能防止退化變異。組培苗采用扦插擴繁,大大降低了成本。目前該栝蔞脫毒苗繁育體系已經運轉4 a,累計推廣脫毒苗近30萬株,田間普遍表現(xiàn)生長勢旺盛,單株結果數(shù)明顯高于多年生苗和實生苗,受到廣大栝蔞種植戶的歡迎。
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