劉進(jìn) 席超

北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

光學(xué)切片顯微技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于生物樣本的三維熒光成像。目前最為常用的光學(xué)切片顯微技術(shù)是激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope, CLSM），CLSM利用點(diǎn)掃描的方法獲得清晰的光學(xué)切片。1997年，M. A. A. Neil等介紹了另外一種光學(xué)切片成像技術(shù)——結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微鏡（structured illumination microscopy, SIM），利用該方法可以在一臺(tái)普通的熒光顯微鏡上實(shí)現(xiàn)光學(xué)切片成像[1]。

1.SIM成像原理

普通熒光顯微鏡在觀察較厚的生物樣本時(shí)，例如觀察組織切片中的多層細(xì)胞。由于受非焦平面雜散熒光的干擾，使得所獲取的熒光圖像變得模糊、對(duì)比度不夠、圖像信噪比不過(guò)高。甚至有時(shí)候一些很重要的結(jié)構(gòu)因此被掩蓋在背景之中，而無(wú)法被觀察到。SIM是將刻有均勻暗條紋的柵格插入熒光光路中（光路圖如圖1所示），因此從顯微鏡中觀察到的焦平面的圖像中有條紋的投影。帶有柵格的圖像中包含了樣本不同結(jié)構(gòu)與焦平面不同距離的信息。有些樣本的結(jié)構(gòu)在焦平面內(nèi)，而有的在焦平面的上方或者下方也進(jìn)入了焦平面內(nèi)。來(lái)自非焦平面的熒光信息在圖像中顯示為比較模糊的區(qū)域。當(dāng)柵格移動(dòng)時(shí)，這部分區(qū)域的來(lái)自焦平面熒光信號(hào)的亮度（對(duì)比度）會(huì)顯著提高，而來(lái)自非焦平面熒光信號(hào)的亮度仍然是比較模糊的。根據(jù)這種亮度的差異，可以用來(lái)區(qū)分熒光信號(hào)是否來(lái)自于焦平面，最后再用一種算法公式通過(guò)圖像處理軟件將三張?jiān)紙D片進(jìn)行計(jì)算和整合，最終得出一張全部來(lái)自焦平面熒光信號(hào)的清晰圖像。該方法也被稱為條紋投影成像技術(shù)[2,3,5,6]。

2.ApoTome光學(xué)成像系統(tǒng)介紹

德國(guó)ZEISS公司基于SIM的成像原理研發(fā)出了ApoTome光學(xué)成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)就是應(yīng)用條紋投影成像技術(shù)來(lái)去除非焦平面熒光影響的。

一套ApoTome光學(xué)成像系統(tǒng)主要由以下幾個(gè)組件所組成。

2.1 一臺(tái)普通的正置或倒置熒光顯微鏡

顯微鏡上要求預(yù)留有安裝ApoTome插片的位置，例如ZEISS公司的Axio Imager.Z1/D1、Axio Observer.Z1/D1等產(chǎn)品均可擴(kuò)展成為ApoTome成像系統(tǒng)。

2.2 ApoTome插片

ApoTome插片中裝有高精度的馬達(dá)和條紋柵格，ApoTome插片中的馬達(dá)可以使柵格移動(dòng)至三個(gè)特定位置，每個(gè)位置可以獲得三張不同的數(shù)碼原始圖像。

2.3 ApoTome校準(zhǔn)工具箱

工具箱中配有相應(yīng)的校準(zhǔn)工具，用于相位校準(zhǔn)和柵格焦距校準(zhǔn)。

2.4 數(shù)碼相機(jī)、計(jì)算機(jī)和AopTome控制軟件

用于獲取原始熒光圖像，并經(jīng)計(jì)算機(jī)處理之后生成一張最終的清晰圖像。

3.ApoTome成像效果及特點(diǎn)

ApoTome成像系統(tǒng)所收集的原始圖片如圖2所示，原始圖片中包含了熒光信號(hào)信息和均勻的暗色條紋。三張圖像經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)處理之后可以生成一張最終圖像如圖3所示。不使用ApoTome成像系統(tǒng)所獲取的普通熒光圖像如圖4所示。經(jīng)對(duì)比之后不難發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ApoTome成像系統(tǒng)所獲取的圖像與普通熒光圖像相比，在去除原始圖像中的柵格投影后能有效地去除非焦平面的雜散熒光，顯著地增強(qiáng)了圖像的銳利度和對(duì)比度。

（以上由Axio Oberver Z1顯微鏡、EC Plan-Neofluar 63x/1.25 Oil物鏡所成像）

ApoTome成像系統(tǒng)主要具有以下特點(diǎn)：

3.1 圖像收集和處理的時(shí)間較短

由于ApoTome成像系統(tǒng)采用的是寬場(chǎng)照明成像，所以與CLSM的點(diǎn)掃描成像相比所需的時(shí)間相對(duì)較快。其圖像處理的時(shí)間取決于圖像的大小，一張512×512圖像約需30ms，一張1300×1000圖像約需100ms[7]。

3.2 圖像的縱向分辨率均一性較好

Arwed Weigel等比較了ApoTome成像系統(tǒng)與CLSM的分辨率差異。研究結(jié)果表明，觀察熒光微球時(shí)，ApoTome的縱向分辨率不如CLSM，而橫向分辨率與普通寬場(chǎng)熒光顯微鏡相比有很大的改善；觀察較均勻的熒光切片時(shí)，ApoTome的縱向分辨率的均一性要優(yōu)于CLSM[8]。

4.展望

ApoTome系統(tǒng)可以從熒光樣本中獲得光學(xué)切面。非焦平面的熒光能被很好地去除，可以增強(qiáng)圖片的銳利度，增強(qiáng)信噪比（對(duì)比度），增強(qiáng)軸向的分辨率。同時(shí)可使用傳統(tǒng)熒光光源，不需使用昂貴的激光，研究者可以最經(jīng)濟(jì)的成本獲得消除熒光影像非焦面雜光的功能。另由于軟件運(yùn)算時(shí)間大大地減少，且不必要采集Z軸多層影像即可做銳化的運(yùn)算處理，研究者得以迅速判斷所采集的影像的樣本優(yōu)劣，并迅速?gòu)闹蝎@得更精確的信息，大大提高了研究的效率。最近也有研究者用非線性的柵格替代線性的柵格[4]，或者將柵格投影從二維擴(kuò)展到三維投影，這些改進(jìn)措施都進(jìn)一步提升了SIM的成像分辨率，有的已經(jīng)甚至超過(guò)了傳統(tǒng)的CLSM。隨著，SIM的技術(shù)不斷創(chuàng)新和發(fā)展，SIM必將在生命科學(xué)研究領(lǐng)域做出更大的貢獻(xiàn)。

[1]M. A. A. Neil, R. Ju?kaitis R, and T. Wilson, Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope, Opt. Lett. 1997 22: 1905-1907.

[2]L. H. Schaefer, D. Schuster, J. Schaffer, Structured illumination microscopy: artefact analysis andreduction utilizing a parameter optimization approach, Journal of Microscopy, 2004, Vol. 216,165-174.

[3]Brakenhoff GJ, Wurpel GW, Jalink K, Oomen L, Brocks L, Zwier JM.,Characterization of sectioning fluorescence microscopy with thin uniform fluorescent layers: Sectioned Imaging Property or SIPcharts., J Microsc. 2005 Sep;219(Pt 3):122-32.

[4]Mats G. L. Gustafsson, Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution, PNAS 2005 vol. 102 no. 37 13081-13086.

[5]José-Angel Conchello, Jeff W Lichtman, Optical sectioning microscopy, Nature Methods 2, 2005, 920 - 931.

[6]Fr′ed′eric Chasles, Beno^it Dubertret and A. Claude Boccara.,Optimization and characterization of astructured illumination microscope, OPTICS EXPRESS,2007, Vol. 15, No. 24 16140.

[7]AxioVison User’s Guide, 2008.

[8]A Weigel, D Schild, A Zeug, Resolution in the ApoTome and the confocal laser scanning microscope: comparison, Journal of Bio medical Optics, 2009,14, 014022.