李琴 軒詩海

（1.黑龍江省完達山乳業(yè)股份有限公司，黑龍江省 哈爾濱 150078）

牛奶，是一種非常健康和營養(yǎng)的食品。然而，乳牛因為疾病治療而服用或被注射抗生素類藥物其殘留物會存在于牛奶中。當(dāng)人類長期食用了含有抗生素殘留物的牛奶，會引起一系列不良反應(yīng)，尤其是一些毒副作用較大或質(zhì)量低劣藥物。如過敏反應(yīng)、被具有抗生素耐藥性的食源性病原體感染、以及致畸作用等。因此，牛奶中抗生素殘留對人類健康的危害不僅是一個公共衛(wèi)生和食品安全問題，也會給國家?guī)斫?jīng)濟負擔(dān)。

抗生素類藥物廣泛地應(yīng)用于乳牛的各種感染性疾病，其品種繁多，例如：β-內(nèi)酰胺類（青霉素、頭孢菌素）；磺胺類；氨基糖甙類（鏈霉素、慶大霉素）；四環(huán)素類；大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、羅紅霉素）；氯霉素類；林可霉素類（林可霉素、克林霉素）；抗細菌的抗生素（磷霉素）等等。

目前國際上常用的獸藥殘留免疫學(xué)快速檢測方法主要有傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金法及SNAP雙流向酶聯(lián)免疫法，均存在檢測種類不能全部覆蓋的缺陷。

發(fā)酵酸度原理是：在經(jīng)殺菌的牛乳中，添加嗜熱鏈球菌培養(yǎng)，在樣品中不含有抗生素情況下，嗜熱鏈球菌將繁殖，發(fā)酵牛乳，牛乳凝固產(chǎn)酸，3小時內(nèi)酸度可達70°T；如樣品中含有抗生素，嗜熱鏈球菌的繁殖將受到抑制，導(dǎo)致牛乳凝固狀態(tài)不好，產(chǎn)酸量少，3小時內(nèi)酸度無法達到70°T。從而判斷牛乳中是否有抗生素殘留。因嗜熱鏈球菌對抗生素極敏感，各類抗生素對其均有抑制作用，所以發(fā)酵酸度法可有效對牛乳中抗生素殘留進行初篩，達到控制有抗奶的目的。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備和材料

1.1.1 滅菌鍋：115℃±1℃

1.1.2 冰箱：0℃～4℃

1.1.3 恒溫培養(yǎng)箱：43℃±1℃

1.1.4 顯微鏡：10×～100×

1.1.5 托盤藥物天平：0g～500g，精確至0.5g

1.1.6 錐形瓶：1000mL、500mL、200mL、100mL

1.1.7 溫度計：0℃～100℃

1.1.8 滅菌試管：16mm×160mm、18mm×180mm及相應(yīng)的試管架

1.1.9 滅菌吸管：1 mL、5 mL、10 mL

1.1.10 接種燈和接種環(huán)

1.2 試劑

1.2.1 嗜熱鏈球菌（Streptococcus Thermophilus）：

1.2.2 0.1mol/L氫氧化鈉溶液。

1.2.3 脫脂乳粉：無抗生素。

1.3 制備及驗證

1.3.1 菌株活力的制備

1.3.1.1 按無菌操作要求，用接種環(huán)挑取適量凍干的嗜熱鏈球菌接種于一支或兩支脫脂乳培養(yǎng)基試管中，搖勻后于43℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，至凝乳結(jié)實、無乳清析出。培養(yǎng)過程中要及時觀察并記錄凝乳時間。

1.3.1.2 選取凝乳較好的一支試管，從中吸取0.2～0.3ml凝乳，再接種于兩支試管中，搖勻后于43℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至凝乳結(jié)實、無乳清析出時取出繼續(xù)傳代，按GB/T 5409檢測酸度。

1.3.1.3 當(dāng)培養(yǎng)基在3.5-4.5小時凝固，凝乳酸度達到70oΤ時，鏡檢確認菌株符合嗜熱鏈球菌形態(tài)后即可認為菌株活力完全恢復(fù)。

1.3.1.4 菌株的保存：培養(yǎng)至穩(wěn)定的菌株可于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，根?jù)菌株自身特性進行定期傳代，一般為七天一次。

1.3.2 菌株活力驗證：

1.3.2.1 鏡檢：革蘭氏染色試驗，于100倍的油鏡顯微鏡下觀察菌體。

1.3.2.2 每一代均要鏡檢，判斷菌株是否正?；蜃儺?，如變異或污染雜菌需重新更換菌株。

1.3.3 培養(yǎng)基的制備

準(zhǔn)確稱取120g無抗生素脫脂乳粉溶于880ml，50℃-60℃的蒸餾水中，充分溶解后分裝于錐形瓶100mL、10mL試管中；用滅菌鍋115℃滅菌20分鐘，冷卻后放置冰箱中備用。

檢測用菌液的制備：將菌株活力按需要擴大培養(yǎng)，擴培條件與菌株活化一樣，接種量為2～3%，培養(yǎng)溫度43℃，發(fā)酵酸度達70oΤ。擴培后菌液放入冰箱中備用(放置時間不能超過一周)。

1.4 操作步驟

1.4.1 樣品處理：液體樣品取200ml，固體樣品準(zhǔn)確稱量24克，溶于176ml，50-60℃的蒸餾水中，充分溶解后放置30分鐘，然后進行水浴殺菌，殺菌條件為95℃，10分鐘。

1.4.2 樣品發(fā)酵：將殺菌后樣品溶液冷卻至45℃進行接種，接種量為3%（無菌操作），充分搖勻后放入43℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2小時取樣檢測酸度，酸度檢驗按GB/T 5409規(guī)定進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照實驗：取酶聯(lián)免疫試劑盒檢測為陽性的牛奶樣品5個，進行發(fā)酵酸度試驗，結(jié)果見表1：

2.2 添加實驗：取無抗牛乳為本底樣品，人為添加磺胺嘧啶，添加量分別為：5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg，進行發(fā)酵酸度試驗，結(jié)果見表2：

3 結(jié)論

發(fā)酵酸度法可有效對牛乳中抗生素殘留進行初篩，方法處理簡單，易操作，試驗成本低，分析周期短，因此該方法可作為原料奶抗生素的快速篩選檢測方法。