安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 劉海進(jìn) 李呂木＊

木質(zhì)素是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定的生物大分子物質(zhì)，其產(chǎn)量?jī)H次于纖維素（Zyskind和Bernstein，1991）。我國(guó)秸稈類物質(zhì)資源豐富，但木質(zhì)素約占其20%，由于動(dòng)物體內(nèi)缺乏降解木質(zhì)素的酶類，因此其飼料價(jià)值較差。研究表明，通過(guò)微生物酶的降解作用，可將飼料原料中的木質(zhì)素分解為可被動(dòng)物吸收利用的小分子物質(zhì)，從而提高其飼用價(jià)值 （陳光耀和曹兵海，2003）。木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP）是木質(zhì)素的生物降解過(guò)程中的主要木質(zhì)素降解酶類，可在木素聚合物內(nèi)形成自由基，導(dǎo)致鍵穩(wěn)定變差從而破壞木質(zhì)素大分子。本文對(duì)近年來(lái)關(guān)于LiP特性、催化機(jī)制、生產(chǎn)及應(yīng)用等方面的研究進(jìn)行了綜述。

1 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的特性與來(lái)源

Kent和Ming等（1983）首次從白腐真菌屬的黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的限制性培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了LiP，并認(rèn)為其屬于氧化還原酶，是真菌分泌的一種含鐵血紅素的糖基化細(xì)胞外蛋白過(guò)氧化物酶。研究表明，LiP的糖基化亞鐵血紅素蛋白質(zhì)通常以多種復(fù)合的形式產(chǎn)生，即含有多種同工酶，分子質(zhì)量一般在37～47 kDa，經(jīng)過(guò)純化后的LiP的分子質(zhì)量在40 kDa左右，等電點(diǎn)為3.5左右，最適酶活溫度為35～55℃，最適 pH 為2～ 5（Asgher等，2006）。 LiP氧化還原電位為1.5 V，在H2O2存在時(shí)，LiP能氧化分解芳香環(huán)多聚體，被認(rèn)為是木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶之一。

LiP主要是由微生物分泌所產(chǎn)生，如黃孢原毛平革菌（Phanerochete chrysosoporium）、彩絨草蓋菌（Coridusversicolor）、變色栓菌（Thametes versicolor）、 煙管菌 （Bjerkandera adusta）、 射脈菌（Phlebia radiata）、鳳尾菇（Pleurotus pulmonanus）朱紅密孔菌 （Pycnoporus cinnabarinu）等。Adhi（1989）研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陽(yáng)性菌（Streptomyces viridosporus）T7A 也可產(chǎn)生 LiP。

2 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的催化機(jī)制及酶活測(cè)定

2.1 催化機(jī)制 LiP是一系列含F(xiàn)e3+、卟啉環(huán)和血紅素輔基的同工酶。Tien和Kirk（1988）認(rèn)為，LiP可利用H2O2及有機(jī)過(guò)氧化物催化一系列底物，其催化作用具有非特異性。Haemmerli等（1986）和Hammel等（1986）研究也發(fā)現(xiàn)LiP的作用底物很廣泛，主要包括酚類和非酚類芳香化合物，可以氧化木質(zhì)素單體、二體、三體以及多環(huán)芳烴（如苯并芘）等底物。其降解底物的特點(diǎn)為：LiP能氧化富含電子的酚型或非酚型芳香化合物，在通過(guò)電子傳遞體攻擊底物時(shí)，能從苯酚或非酚類的苯環(huán)上奪取一個(gè)電子，將其氧化成自由基，繼而以鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生許多不同的自由基，導(dǎo)致底物分子中主要鍵斷裂，然后發(fā)生一系列的裂解反應(yīng)。具體反應(yīng)機(jī)制見(jiàn)圖1。

圖1 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的催化循環(huán)

LiP化合物Ⅰ攜帶H2O2的兩個(gè)氧化當(dāng)量，一個(gè)為Fe4+-O中心，另一個(gè)形成卟啉的陽(yáng)離子自由基?；|(zhì)R被化合物Ⅰ氧化成芳基陽(yáng)離子自由基，然后通過(guò)一系列的非酶反應(yīng)生成最終的產(chǎn)物。木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)單元之間主要通過(guò)醚鍵（β-O-4）和碳碳鍵（C-C）的方式連接，LiP通過(guò)催化木質(zhì)素側(cè)鏈的Cα-Cβ鏈?zhǔn)蛊鋽嗔褟亩到饽举|(zhì)素（Hammel等，1993）。

2.2 酶活測(cè)定 LiP酶活的測(cè)定主要采用黎蘆醇氧化速率法。由于黎蘆醇是LiP作用的直接底物，根據(jù)310 nm處測(cè)得的黎蘆醇的吸光度值大小來(lái)判定LiP的酶活。具體方法為：1 mL反應(yīng)液中含0.2 mL藜蘆醇溶液、0.4 mL酒石酸緩沖液（250 mmoL/L，pH 3.0）、0.4 mL 培養(yǎng)液或稀釋液、20 μL 20 mmoL/L H2O2溶液，于 30 ℃反應(yīng) 2 min，測(cè)定310 nm的吸光度值。在空白組中，以蒸餾水代替H2O2溶液，其他反應(yīng)物不變。1個(gè)酶活單位（U）的定義為每分鐘氧化黎蘆醇產(chǎn)生1 μmol黎蘆醛所需的酶量（Tien和 Kirk，1988）。

3 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的生產(chǎn)

3.1 游離培養(yǎng)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶 游離培養(yǎng)LiP合成的主要影響因素為培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件（氧濃度）。張紅等（2005）在限碳靜置、限氮振蕩不加藜蘆醇的環(huán)境下，研究發(fā)酵條件對(duì)黃孢原毛平革菌合成LiP影響的結(jié)果顯示：限碳靜置培養(yǎng)時(shí)，酶活可達(dá)1193 U/L，碳源以葡萄糖0.04%和糊精0.16%同時(shí)存在比單一葡萄糖作為碳源獲得較高的酶活；限氮振蕩培養(yǎng)時(shí)，所得酶活可達(dá)980 U/L。畢鑫等（2003）在靜置和振蕩兩種培養(yǎng)條件下研究營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)白腐菌合成LiP影響的結(jié)果表明：靜置培養(yǎng)時(shí)，LiP在碳氮比低的培養(yǎng)基中顯示較高的酶活力，碳源以葡萄糖0.02%和糊精0.18%同時(shí)存在或分段加入要比單一葡萄糖作為碳源時(shí)獲得更高的酶活；振蕩培養(yǎng)時(shí)，在碳氮比高的培養(yǎng)基中LiP酶活最高，而類似于靜置培養(yǎng)的氮源組合及分段模式卻明顯抑制LiP的合成；優(yōu)化后，靜置培養(yǎng)在第6天可獲得7560 U/L的酶活，振蕩培養(yǎng)在第8天獲得6500 U/L的酶活?？率朗〉龋?000）研究發(fā)現(xiàn)，氧濃度對(duì)固定化黃孢原毛平革菌合成過(guò)氧化物酶影響較大，空氣環(huán)境下限碳培養(yǎng)黃孢原毛平革菌，其合成的LiP最高活力可達(dá)360 U/L，比通純氧條件下限碳培養(yǎng)時(shí)高160%。

3.2 固定化培養(yǎng)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶 近年來(lái)，采用固定化細(xì)胞培養(yǎng)合成LiP已得到了廣泛的重視，與游離細(xì)胞培養(yǎng)相比，其能更有效地合成LiP。目前已采用多種載體對(duì)黃孢原毛平革菌的固定，其中用尼龍網(wǎng)、硅管、聚丙烯、不銹鋼、瓊脂糖和瓊膠顆粒等均取得了較好的效果 （Faison和Kirk，1985）。固定化后的菌絲穩(wěn)定性增強(qiáng)并且可以重復(fù)利用。吳葉明等（2008）用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行黃孢原毛平革菌來(lái)源的LiP固定化試驗(yàn)的結(jié)果表明，在樹(shù)脂1.0 g、酶液 pH 4.5、加酶量 87.2 U、吸附溫度25℃、吸附4 h、0.2%戊二醛、處理120 min條件下，可獲得最佳的固定化效果，固定化酶活可達(dá)到16 U/g。劉東華等（2009）通過(guò)共價(jià)結(jié)合法將LiP固定于聚氨酯泡沫上，發(fā)現(xiàn)固定化酶活為1.45 U/g（泡沫干重），酶活回收率達(dá)到34.79%，提高了固定化LiP的熱穩(wěn)定性，且擴(kuò)大了固定化LiP穩(wěn)定性的pH范圍，且其重復(fù)利用性好。

3.3 利用反應(yīng)器生產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶 目前，有很多關(guān)于利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)LiP的報(bào)道。由于LiP胞外生產(chǎn)的特點(diǎn)要求，因此除了必須滿足菌體需要的營(yíng)養(yǎng)限制（限碳或限氮）、足夠的供氧等環(huán)境條件外，還應(yīng)避免其胞外酶的結(jié)構(gòu)及活性遭受剪切力等因素的破壞。與游離和固定化培養(yǎng)相比，生物反應(yīng)器有以下幾個(gè)特點(diǎn)：能夠控制內(nèi)部流體混和均勻、剪切力適宜；為了給細(xì)胞生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物酶的合成提供最佳的環(huán)境條件，需要能夠?qū)Ψ磻?yīng)器中的pH、溫度、溶解氧、氧化還原勢(shì)、攪拌轉(zhuǎn)速等參數(shù)進(jìn)行測(cè)量和控制；必須防止雜菌污染，維持純種培養(yǎng)等（岑沛霖，2004）。所以利用生物反應(yīng)器本身的結(jié)構(gòu)和運(yùn)行參數(shù)對(duì)其產(chǎn)酶至關(guān)重要。

目前主要使用以下幾種生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)LiP。Couto等（2002）在機(jī)械攪拌式反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)了固體培養(yǎng)，LiP酶活均值高達(dá) 246.8 U/L。Dominguez等（2001）采用轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器半浸沒(méi)培養(yǎng)黃孢原毛平革菌，LiP的酶活達(dá)364 U/L。張朝暉等（2003）在三相鼓泡塔反應(yīng)器中培養(yǎng)黃孢原毛平革菌，在通氣量為 1.0 L/（L·min）時(shí)，LiP 酶活最高達(dá) 367 U/L。Ruggeri和 Sassi（2003）利用滴流床生物反應(yīng)器間歇培養(yǎng)黃孢原毛平革菌，LiP酶活達(dá)1220 U/L。Shim和 Kawamoto（2002）把生長(zhǎng)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基交替通入到8 L的固定床反應(yīng)器中間歇培養(yǎng)合成LiP，其最高酶活為1800 U/L。而Gerin等（1997）比較了由氣體攪動(dòng)的氣升式反應(yīng)器、鼓泡式反應(yīng)器和有螺旋槳攪動(dòng)的攪拌式反應(yīng)器后發(fā)現(xiàn)，使用氣升式反應(yīng)器LiP酶活的最大值達(dá)4500 U/L。綜合上述研究可以發(fā)現(xiàn)，使用氣升式反應(yīng)器能夠獲得更高的LiP的酶活。

4 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的應(yīng)用

4.1 在畜牧生產(chǎn)中 趙紅霞等（2002）利用白腐真菌降解秸稈中的木質(zhì)素和纖維素，使其成為含有酶的糖類，提高了秸稈的適口性，易于消化吸收。Celeux和Lavergne（2005）利用白腐真菌的菌絲分泌的超纖維氧化酶可溶解秸稈表面的蠟質(zhì)，菌絲進(jìn)入秸稈內(nèi)部并產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶、內(nèi)切聚糖酶、外切糖酶，從而可降解木質(zhì)素和纖維素。其中機(jī)制可能為L(zhǎng)iP和錳過(guò)氧化物酶（MnP）在分子氧的參與下，依靠自身形成的H2O2觸發(fā)啟動(dòng)一系列自由基鏈反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)素?zé)o特異性的徹底氧化，使秸稈降解成為含有酶的單糖，從而提高了秸稈的消化性。賈燕南等（2008）研究表明LiP和MnP可降解四環(huán)素，且在酶活為40 U/L時(shí)，LiP比MnP的降解能力強(qiáng)；對(duì)于LiP，當(dāng)其酶活從15 U/L升高至40 U/L時(shí)，四環(huán)素降解率提高約15%，當(dāng)酶活進(jìn)一步升高至70 U/L時(shí)，降解率變化不大。

4.2 其他 LiP在降解有機(jī)污染物、生物制漿、處理污染廢水等方面還有廣泛的應(yīng)用。張朝暉等（2002）研究表明，黃孢原毛平革菌所產(chǎn)的LiP能氧化多種多氯酚類物質(zhì)，有些酚類物質(zhì)常常是廣譜生物殺蟲(chóng)劑或除草劑的前體。林鹿等（1996）報(bào)道，在LiP單獨(dú)使用或與其他酶的適當(dāng)配合處理紙漿，使得制得的紙張具有良好的抗張強(qiáng)度和平滑度，這不僅提高紙張白度而且還降低了紙張的卡伯值。Gary等 （2003）研究發(fā)現(xiàn)LiP可以處理2，4-二溴苯酚等工業(yè)廢水，在氧化的過(guò)程中形成二聚體、三聚體和四聚體，從而消除了廢水的毒性。

5 展望

農(nóng)作物秸稈木質(zhì)素含量較高，難以作為有效的飼料來(lái)源。隨著對(duì)LiP的催化機(jī)制、相關(guān)基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控等的深入研究，采用優(yōu)良菌種生產(chǎn)高效的木質(zhì)素降解酶制劑，對(duì)秸稈等潛在飼料資源開(kāi)發(fā)以及廢水、廢物處理等具有重要意義。

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