林 欣,李 敏,胡亞卓,韓志濤,張紅紅,尚愛加,高德偉,周定標(biāo)

(1.解放軍總醫(yī)院南樓外二科,北京 100853;2.總裝備部北京黃寺美容外科醫(yī)院創(chuàng)傷美容科,北京 100120;3.解放軍總醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所,北京 100853;4.解放軍總醫(yī)院神經(jīng)外科,北京 100853;5.復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200032)

腦紅蛋白(neuroglobin,NGB)是繼血紅蛋白、肌紅蛋白之后發(fā)現(xiàn)的第三類攜氧球蛋白,其主要在視網(wǎng)膜、腦皮質(zhì)神經(jīng)元高表達(dá)[1]。目前研究表明,NGB對(duì)腦缺血、缺氧性損害具有保護(hù)作用[2～4]。由于其特有的紅蛋白家族的特性(與氧的可逆結(jié)合)、特異的神經(jīng)元高表達(dá)及可能的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子的功能,使其成為一種備受期待的神經(jīng)元損傷修復(fù)介質(zhì)。目前的研究表明[5～7],NGB在神經(jīng)元缺血、缺氧性損傷急性期呈代償性表達(dá)增高,可增強(qiáng)神經(jīng)元對(duì)缺血、缺氧性損害的耐受;過表達(dá)NGB可顯著延長缺血、缺氧神經(jīng)元的存活期,相反,抑制NGB表達(dá),則縮短神經(jīng)元存活期。我們?cè)谇捌谘芯恐杏^察到顱腦創(chuàng)傷后腦紅蛋白高表達(dá),提示其可能參與神經(jīng)元?jiǎng)?chuàng)傷后保護(hù)[5]。對(duì)NGB基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在NGB的啟動(dòng)子區(qū)域含有兩個(gè)p53結(jié)合位點(diǎn),提示NGB的表達(dá)可能受p53調(diào)控。p53是一種重要的凋亡相關(guān)基因,在神經(jīng)元損傷應(yīng)激中,p53是神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子,具有促凋亡作用。顱腦創(chuàng)傷本身及其繼發(fā)的腦腫脹所造成的缺血、缺氧性損害也可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。因此,在顱腦創(chuàng)傷中,NGB和神經(jīng)元凋亡的關(guān)系、其在創(chuàng)傷及其繼發(fā)之缺血、缺氧性損害所致的細(xì)胞凋亡中起何種作用,均值得進(jìn)一步探討。本研究擬通過探究大鼠腦顱腦創(chuàng)傷后NGB和凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的變化規(guī)律,初步探討NGB表達(dá)和細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型及標(biāo)本制備

雄性SD大鼠50只,體重350～400 g(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分為10組(n=5):空白對(duì)照組 、傷后 30min 、1 h、2 h、6 h 、12 h 、24 h、48 h、72 h和5 d組。以Marmarou's法[6]制備閉合性重型顱腦損傷模型(落體重量為450 g,高度170 cm),3%異氟烷(上海ABBOTT制藥公司)短時(shí)(2 min)吸入麻醉后致傷。分別于致傷后30 min、1 h、2 h 、6 h、12 h、24 h 、48 h、72 h、5 d 將實(shí)驗(yàn)組大鼠斷頭 ,迅速取腦,置入10%福爾馬林溶液中固定2周?？瞻讓?duì)照組同樣暴露,但不致傷,此后亦取腦置入10%福爾馬林溶液中固定2周。取腦組織標(biāo)本,于打擊區(qū)切取腦組織塊行組織脫水、石蠟包埋,腦組織切片厚度5 μ m。

1.2 免疫組化染色

NGB單克隆抗體(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所十三室饋贈(zèng));兔抗Bax多克隆抗體(Santa Cruz公司);兔抗Bcl-2多克隆抗體(Santa Cruz公司);二步法免疫組化試劑盒(Dako公司)。常規(guī)脫蠟至水,以3%過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶,微波修復(fù)抗原,各步驟間以PBS沖洗3 min×3次。每張切片加1∶200一抗工作液每張50 μ l,4℃孵育過夜。其余操作步驟參照Dako公司二步法免疫組化試劑盒說明進(jìn)行,顯色時(shí)間1 min。之后脫水、透明、封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

1.3 圖像分析

選用熒光顯微鏡系統(tǒng)(Olympus BX-60型)及顯微鏡數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng)(Olympus DP10型)進(jìn)行圖像采集。各切片選擇4個(gè)不同的視野照相(顯微鏡放大倍率為200倍),各切片選擇視野的位置保持一致。將照片輸入計(jì)算機(jī)后,使用圖像分析軟件進(jìn)行分析。照片經(jīng)過灰度轉(zhuǎn)換和二值化處理后,由軟件標(biāo)記并計(jì)算出每張照片中陽性細(xì)胞的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠顱腦損傷后致傷區(qū)皮層神經(jīng)元NGB免疫組化染色

免疫組化染色顯示NGB陽性細(xì)胞呈棕色,陽性物質(zhì)位于神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)和突起中(圖1、2)。選取雙側(cè)皮層致傷區(qū),進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并分析。如圖3所示,大鼠顱腦創(chuàng)傷后致傷區(qū)皮質(zhì)神經(jīng)元NGB表達(dá)呈“雙峰”改變,損傷后30 min即可見損傷區(qū)皮層NGB陽性神經(jīng)元數(shù)量增高;至損傷后2 h,皮層NGB陽性神經(jīng)元數(shù)量達(dá)到高峰;此后逐漸下降,至損傷后48～72 h,又再次出現(xiàn)NGB表達(dá)升高,并于72 h再次達(dá)峰值;繼之開始下降,至傷后5 d陽性細(xì)胞數(shù)量仍高于正常水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,傷后2 h組NGB陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)與其余各組比較具有顯著差異(P＜0.01),傷后72 h組與對(duì)照、30 min組比較具有顯著差異(P＜0.01,PP＜0.05,圖3見下頁)。

Fig.1 Expression of NGB in cortical neurons(×100)

Fig.2 Expression changes of NGB in cortical neurons 2 h post-TBI(×100)

Fig.3 Expression changes of NGB in cortical neurons post-TBI

2.2 SD大鼠顱腦損傷后致傷區(qū)皮層神經(jīng)元Bcl-2、Bax表達(dá)檢測

2.2.1 Bcl-2 正常對(duì)照組腦切片皮層神經(jīng)元可見散在的Bcl-2陽性表達(dá),數(shù)量不多,陽性物質(zhì)定位于神經(jīng)細(xì)胞的胞漿中(圖4)。損傷后30 min,皮層致傷區(qū)Bcl-2陽性細(xì)胞明顯增多(P＜0.05);至損傷后2 h,陽性細(xì)胞數(shù)大量增加并達(dá)到高峰(P＜0.01,圖5);此后,Bcl-2陽性細(xì)胞開始減少,但是在傷后24 h再次出現(xiàn)表達(dá)高峰;之后,陽性細(xì)胞再次逐漸減少,至損傷后5 d,Bcl-2表達(dá)仍高于正常水平(圖6)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,傷后2 h組Bcl-2陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)與其余各組比較具有顯著差異(與30 min、1 h、6 h組比較P＜0.05,與其它各組比較P＜0.01),傷后24 h組與30 min組比較具有顯著差異(P＜0.05,圖6)。

Fig.4 Expression of Bcl-2 in cortical neurons(×100)

Fig.5 Expression changes of Bcl-2 in cortical neurons 2 h post-TBI(×100)

Fig.6 Expression changes of Bcl-2 in cortical neurons post-TBI

2.2.2 Bax 正常對(duì)照組腦切片皮層區(qū)可檢測到Bax陽性細(xì)胞,數(shù)量低于Bcl-2陽性細(xì)胞,陽性物質(zhì)定位于神經(jīng)元胞漿中(圖7)。損傷后30 min,致傷區(qū)皮層Bax陽性細(xì)胞顯著增多;于損傷后2h達(dá)到高峰(P＜0.01,圖8)。此后,Bax陽性細(xì)胞開始減少,雖然在傷后48 h及72 h出現(xiàn)輕微波動(dòng),至損傷后5 d,致傷區(qū)皮層Bax陽性細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖9)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,傷后2 h組Bax陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)與其余各組比較具有顯著差異(與6 h組比較P＜0.05,與12 h～5 d組比較P＜0.01,圖9)。

Fig.7 Expression of Bax in cortical neurons(×100)

Fig.8 Expression changes of Bax in cortical neurons2 h post-TBI(×100)

Fig.9 Expression changes of Bax in cortical neurons post-TBI

2.3 損傷后Bax/Bcl-2的動(dòng)態(tài)變化

顱腦創(chuàng)傷后大鼠神經(jīng)元Bax/Bcl-2比值變化呈現(xiàn)“雙峰”狀。傷后30 min就出現(xiàn)Bax/Bcl-2比值的急劇升高,并于傷后6 h達(dá)峰值;此后逐漸下降,于傷后48 h、72 h又再次出現(xiàn)波動(dòng)性增高;最終于傷后5 d恢復(fù)至接近正常水平(圖10)。

Fig.10 Changes of ratio of Bax to Bcl-2 in traumatic brain injury rats

3 討論

3.1 顱腦創(chuàng)傷后大鼠腦組織NGB表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

本研究觀測了大鼠顱腦創(chuàng)傷后30 min至5 d致傷區(qū)神經(jīng)元NGB的表達(dá)變化情況。發(fā)現(xiàn)NGB的表達(dá)呈現(xiàn)“雙峰”樣變化:于傷后2 h,皮層NGB陽性神經(jīng)元數(shù)量大量增多,達(dá)到首個(gè)高峰(P＜0.01);此后逐漸下降,至損傷后48 h、72 h,再次出現(xiàn)NGB表達(dá)升高,并于傷后72 h達(dá)峰值;繼之下降,至傷后5 d陽性細(xì)胞數(shù)量仍高于正常水平。這種NGB在顱腦創(chuàng)傷后超早期(3 h內(nèi))表達(dá)迅速上調(diào)的表現(xiàn),很可能是神經(jīng)元對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激的保護(hù)性反應(yīng)。這與我們前期關(guān)于顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元NGB核酸水平變化的研究結(jié)果相一致[5],對(duì)NGB-cDNA的實(shí)時(shí)定量研究發(fā)現(xiàn)顱腦創(chuàng)傷可直接誘導(dǎo)NGB核酸表達(dá),在傷后30 min即出現(xiàn)首次核酸表達(dá)高峰?？赡苡捎跈C(jī)械性創(chuàng)傷可直接造成線粒體損害、Na+-K+-ATP酶失活,致使神經(jīng)元處于氧化應(yīng)激狀態(tài)—能量代謝障礙、膜穩(wěn)定性破壞。進(jìn)而誘導(dǎo)NGB代償性表達(dá)上調(diào),以增加神經(jīng)元的氧供、維持細(xì)胞膜穩(wěn)定。然而,神經(jīng)元對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激的代償能力有限,NGB并非隨著傷情進(jìn)展而持續(xù)高表達(dá),而于傷后6～24 h逐漸下降。而傷后48～72 h NGB表達(dá)的再次小幅增高,可能是源于顱腦創(chuàng)傷繼發(fā)腦腫脹致顱內(nèi)低灌注,造成神經(jīng)元缺血、缺氧性損傷。Marmarou等[6]對(duì)其致傷模型的研究發(fā)現(xiàn):腦腫脹于傷后6 h開始出現(xiàn),并于傷后24 h達(dá)高峰,持續(xù)數(shù)天后逐漸消退。正是顱腦創(chuàng)傷的“二次打擊”—繼發(fā)缺血、缺氧性損害誘發(fā)了NGB的表達(dá)上調(diào)。我們前期關(guān)于顱腦創(chuàng)傷后NGB-cDNA的實(shí)時(shí)定量研究亦發(fā)現(xiàn)NGB的核酸表達(dá)在傷后48 h再次升高達(dá)峰值[5]。目前的研究表明氧化應(yīng)激與抗氧化儲(chǔ)備的耗竭是創(chuàng)傷性腦損害中神經(jīng)元損傷的重要因素。Wakasugi等[7]的研究提示,NGB可能是腦組織的氧化應(yīng)激感受器,其與G蛋白信號(hào)系統(tǒng)調(diào)節(jié)器和G蛋白受體激酶具有同源性,氧化型NGB(Fe3+),可使鳥嘌呤核苷酸失去抑制活性,進(jìn)而抑制GDP轉(zhuǎn)化為GTP;而還原型的NGB可釋放Gβγ,激活G蛋白信號(hào)系統(tǒng),延長神經(jīng)元存活期。Khan等[8]的研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)NGB的轉(zhuǎn)基因小鼠心肌、腦組織對(duì)缺氧性損害的耐受顯著提高—在缺血、低氧損傷中腦梗死面積減少30%、心肌梗死面積減少25%,NGB的過表達(dá)伴隨著血管內(nèi)皮細(xì)胞的一氧化氮合酶的表達(dá)水平增高,提示NGB可能通過促進(jìn)內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)的高表達(dá)保護(hù)心肌、神經(jīng)元耐受缺血性損害。此外,尚有研究認(rèn)為,低氧誘導(dǎo)NGB表達(dá)可能與低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)有關(guān)[2,9]。HIF-1在低氧應(yīng)答中居于核心地位,對(duì)紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生成因子、糖酵解酶類和一氧化氮合酶的基因轉(zhuǎn)錄均有調(diào)節(jié)作用。在NGB基因5'端非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了多條HIF-1結(jié)合位點(diǎn)相同序列[9],HIF-l的誘導(dǎo)子,如鈷和去鐵胺等,均能使NGB基因表達(dá)增強(qiáng)[2],均提示NGB可能是HIF-1的靶基因。NGB在顱腦創(chuàng)傷后超早期的表達(dá)上調(diào),提示NGB是一種應(yīng)激反應(yīng)的效應(yīng)器或調(diào)節(jié)器,參與或是喚醒機(jī)體的其它內(nèi)源性應(yīng)激保護(hù);而其在傷后急性期的再次高表達(dá),表明NGB具有神經(jīng)保護(hù)作用?；贜GB與氧的特殊親和力,可提高神經(jīng)元對(duì)缺血、低氧性損害的耐受力,延緩或避免凋亡的啟動(dòng)。

3.2 顱腦損傷后大鼠腦組織凋亡相關(guān)基因 Bax、Bcl-2表達(dá)的變化

凋亡,又稱程序性細(xì)胞死亡,其與胚胎分化、傷口愈合、腫瘤發(fā)生、先天性疾病、缺血再灌注損傷、器官功能衰竭、衰老過程以及神經(jīng)退行性變等都有密切關(guān)系。在顱腦創(chuàng)傷中,損傷的發(fā)生不僅與神經(jīng)元壞死有關(guān),與神經(jīng)元凋亡亦關(guān)系密切。近年來對(duì)Bcl-2家族與凋亡關(guān)系的研究較為深入。Martinou等[10]用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使小鼠神經(jīng)元內(nèi)Bcl-2過度表達(dá),梗塞灶減少了50%,證實(shí)了Bcl-2具有神經(jīng)元保護(hù)作用。Bax是Bcl-2家族的另一個(gè)主要成員,功能上與Bcl-2相反,該蛋白可與Bcl-2形成異源二聚體,從而抑制Bcl-2的功能。當(dāng)Bax過表達(dá)時(shí),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。一般認(rèn)為Bax/Bcl-2比值決定細(xì)胞受刺激后存活或死亡,Bax蛋白占優(yōu)勢(shì)時(shí)細(xì)胞凋亡,Bcl-2蛋白占優(yōu)勢(shì)時(shí)則細(xì)胞存活。本研究的結(jié)果顯示,大鼠顱腦創(chuàng)傷后致傷區(qū)神經(jīng)元Bcl-2的表達(dá)與NGB的表達(dá)相似,呈現(xiàn)“雙峰”樣變化,分別于傷后2 h、24 h出現(xiàn)兩次峰值表達(dá)。這表明Bcl-2對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)?chuàng)傷性應(yīng)激及繼發(fā)缺血低氧性損害非常敏感,在超早期的創(chuàng)傷應(yīng)激(傷后30 min～2 h)、繼發(fā)腦腫脹并缺血低氧性損害時(shí)(傷后24～72 h),Bcl-2迅速出現(xiàn)保護(hù)性表達(dá)上調(diào),尤其在神經(jīng)元的繼發(fā)性缺血低氧損害階段,呈現(xiàn)持續(xù)性高表達(dá)(傷后24～72 h)。與Bcl-2不同,顱腦創(chuàng)傷后Bax的表達(dá)并未呈現(xiàn)明顯“雙峰”樣改變。于損傷后2 h達(dá)到表達(dá)高峰后,Bax陽性細(xì)胞開始減少。值得注意的是,盡管致傷2h后皮層神經(jīng)元Bcl-2和Bax的表達(dá)都有所下降,然而Bax/Bcl-2比值還在升高,神經(jīng)元仍趨于凋亡。傷后24 h,由于彌漫性腦腫脹的發(fā)生并達(dá)到高峰,造成Bax表達(dá)的再次波動(dòng)性升高,此時(shí) Bcl-2的表達(dá)不足以抑制Bax,形成了Bax/Bcl-2比值的二次增高,神經(jīng)元再次趨于凋亡。上述結(jié)果表明:在顱腦創(chuàng)傷超早期(30 min～2 h),創(chuàng)傷應(yīng)激導(dǎo)致Bax基因迅速激活、表達(dá)增高,啟動(dòng)神經(jīng)元凋亡。同時(shí),Bcl-2亦被激活并大量表達(dá),試圖遏制凋亡。至創(chuàng)傷急性期(24～72 h),隨著顱腦創(chuàng)傷所致彌漫性腦腫脹的發(fā)生和加劇,使得腦組織的有效灌注下降,進(jìn)而造成神經(jīng)元的缺血、低氧性損害的發(fā)生,此時(shí)再次出現(xiàn)Bax、Bcl-2基因的表達(dá)增加,但是Bcl-2的表達(dá)不足以抑制細(xì)胞凋亡,神經(jīng)元再次趨于凋亡。

3.3 顱腦損傷過程中NGB表達(dá)與神經(jīng)元凋亡的相關(guān)性

綜合分析NGB、Bcl-2、Bax和 Bax/Bcl-2比值的動(dòng)態(tài)變化的趨勢(shì),結(jié)果表明:(1)在顱腦創(chuàng)傷后的超早期,NGB、Bcl-2及Bax均呈現(xiàn)迅速反應(yīng)性增高,其中NGB的增幅最為顯著,尤其在傷后30 min～1 h期間。而同期 Bax/Bcl-2比值增幅明顯減小(圖10)。(2)Bcl-2對(duì)神經(jīng)元的傷害性應(yīng)激十分敏感,其在傷后超早期及出現(xiàn)對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激的反應(yīng)性表達(dá)增高,在傷后12～24 h,隨著彌漫性腦腫脹的發(fā)生、繼發(fā)缺血低氧性損害的產(chǎn)生,其再次出現(xiàn)保護(hù)性表達(dá)上調(diào),并始終保持在一個(gè)較高的水平拮抗神經(jīng)元的凋亡。而NGB與其在顱腦創(chuàng)傷后的變化十分相似,提示NGB可能對(duì)神經(jīng)元凋亡具有拮抗作用。(3)NGB對(duì)創(chuàng)傷性應(yīng)激的反應(yīng)迅速,于傷后超早期表達(dá)迅速增高;而其在創(chuàng)傷后急性期對(duì)繼發(fā)性缺血低氧性損害反應(yīng)滯后于Bcl-2,傷后24 h致傷區(qū)神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)再次達(dá)峰值,而該區(qū)神經(jīng)元NGB表達(dá)于24 h后方出現(xiàn)小幅上升,直至傷后72 h方出現(xiàn)表達(dá)高峰。提示盡管NGB對(duì)缺血低氧性損害之神經(jīng)元具有保護(hù)作用,但有限,可能取決于尚存活神經(jīng)元的數(shù)量及神經(jīng)元損害的程度。(4)在傷后48～72 h,隨著彌漫性腦腫脹的發(fā)生與發(fā)展,繼發(fā)缺血、低氧性損害,此時(shí)NGB再次出現(xiàn)表達(dá)增高,并于72 h達(dá)峰值。而同期(48～72 h)Bax/Bcl-2比值上升趨勢(shì)亦出現(xiàn)明顯減緩并隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖10)。以上均提示:NGB的高表達(dá)在一定程度上可以拮抗創(chuàng)傷應(yīng)激及傷后繼發(fā)缺血、低氧性損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡,在顱腦創(chuàng)傷的超早期(＜3 h)、急性期(＜72 h)可能具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

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