楊 立

(西北民族大學(xué)體育學(xué)院,甘肅 蘭州 730030)

大鼠力竭游泳運(yùn)動(dòng)外周血內(nèi)mi-422a與大腦皮質(zhì)Bcl-w表達(dá)與運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞

楊 立

(西北民族大學(xué)體育學(xué)院,甘肅 蘭州 730030)

研究目的:探討外周血內(nèi)Mir-422a可否監(jiān)測(cè)運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞。研究方法:健康雄性W ister大鼠 36只,隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)、一次性力竭運(yùn)動(dòng)組 (E組)。力竭運(yùn)動(dòng)后即刻、12h和 24h取各組外周血和大腦皮質(zhì)分別采用 real-time PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)各組外周血Mir-422a和大腦皮質(zhì)Bcl-w表達(dá)。結(jié)果:力竭運(yùn)動(dòng)后即刻Mir-422a表達(dá)降低 (P<0.05),而Bcl-w表達(dá)升高 (P<0.05);12h后Mir-422a表達(dá)逐漸升高,而Bcl-w表達(dá)逐漸降低,24h均基本恢復(fù)到安靜水平。結(jié)論:外周血內(nèi)Mir-

422a的表達(dá)有望成為運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞;力竭游泳運(yùn)動(dòng);Mir-422a;bcl-w

MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為 18-25個(gè)核苷酸左右的內(nèi)源性非編碼小 RAN。miRNA在進(jìn)化上高度保守,具有轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控功能。近年,越來(lái)越多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí) miRNA存在組織特異性[1-4]。不同的疾病或亞臨床狀態(tài)對(duì)應(yīng)不同的MiRNA的改變,且此差異存在于外周血內(nèi)[5]。2008年,文全慶[6]等人采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)大鼠腦缺血急性腦組織中MiRNA的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn):缺血缺氧條件下可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)miRNA的變化,主要集中在細(xì)胞凋亡基因、細(xì)胞周期基因和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因三個(gè)方面。大量研究證實(shí)凋亡相關(guān)因子在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用,最近醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn) Mir-422a(microRNA-

422a)是凋亡發(fā)生的調(diào)控基因[7]。

本研究旨在通過(guò)大鼠一次性力竭游泳運(yùn)動(dòng)模型,動(dòng)態(tài)觀察力竭運(yùn)動(dòng)后外周血內(nèi)Mir-422a的表達(dá)變化和大腦皮質(zhì)內(nèi)Bcl-w的表達(dá)變化,探討外周血內(nèi)Mir -422a可否預(yù)警運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞,為運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞的監(jiān)測(cè)提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康雄性W ister大鼠 36只,體重 200±15g(由上海西普爾 -必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)。大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng),進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲水。室溫保持20-22℃,相對(duì)濕度 45-50%,光照時(shí)間為 12h/d。大鼠按體重分層,參照隨機(jī)數(shù)字表分為兩組:對(duì)照組 (C組,n=8)自由飲水進(jìn)食,不受任何干預(yù);一次性力竭運(yùn)動(dòng)組(E組,n=32)進(jìn)行負(fù)自身體重 3%的一次性力竭游泳運(yùn)動(dòng),E組又依據(jù)取材時(shí)間不同分為力竭后即刻取材 E0組、12h后取材 E12組和 24h后取材 E24組各 8只。力竭表現(xiàn):鼻孔或大鼠整個(gè)沒(méi)入水面一下 5 -10s不能主動(dòng)上浮。

1.2 取材

E組即刻、12h和 24h腹腔注射 3ml/kg水合氯醛(10%)麻醉。心臟體外穿刺抗凝取血 1ml備用;斷頭取大腦皮質(zhì),置 4%的甲醛中固定備用。C組在力竭游泳前 1d取材。

1.3 MiRNA的提取與Mir-422a的檢測(cè)

全血中MiRNA的提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)AB公司,英文名稱為 Rat RiboPure(T M)-Blood Kit(AB code: AM1951)。反轉(zhuǎn)錄按照 FG,Taqman(r)microRNA RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作 (AB code:4369016)。Mir-422a引物試劑盒由 AB公司設(shè)計(jì)合成,內(nèi)參選擇 U6 (B)。相關(guān)耗材均購(gòu)自美國(guó) AB公司,所有操作均按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.4 免疫組織化學(xué)測(cè)定Bcl-x

Bcl-x抗體購(gòu)自北京中山生物科技有限公司,具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。觀察大鼠大腦皮質(zhì)Bcl-x的積分光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用 SPSS 13.0,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 mean±SD表示,樣本均數(shù)做 t檢驗(yàn)檢測(cè),P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 MiRNA的表達(dá)

本研究采用美國(guó)AB公司 TaqMan MiRNA分析技術(shù),由擴(kuò)增曲線可以得知,產(chǎn)物特異性好(如圖 1)。各組的 CT值經(jīng) U6 MiRNA標(biāo)注化后結(jié)果如圖 2所示。實(shí)驗(yàn)采用 15μl的反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)條件為16℃×30min,42℃×30min,85℃×5min,然后 4℃× 30min。PCR的反應(yīng)條件為 95℃×10min,然后 40個(gè)循環(huán)的 95℃×15sec,60℃×60sec。Mir-422a的表達(dá)為運(yùn)動(dòng)后即刻降低 (P<0.05),此后逐漸升高,24h后基本回復(fù)到安靜水平。

2.2 Bcl-w的表達(dá)

我們采用了免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)Bcl-w的表達(dá),由 Bcl-w的積分光密度值可知,Bcl-w的表達(dá)變化與Mir-422a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),力竭后即刻達(dá)峰,此后逐漸下降,24h后基本恢復(fù)到安靜水平(圖 3)。

圖 3 大腦皮質(zhì)內(nèi)Bcl-w表達(dá)的積分光密度值

3 分析與討論

運(yùn)動(dòng)性疲勞是造成運(yùn)動(dòng)員機(jī)能下降的重要因素,也是運(yùn)動(dòng)員傷病產(chǎn)生的主要原因,它制約著運(yùn)動(dòng)員競(jìng)技能力的提高。林俊峰[8]選取血尿素、血睪酮、皮質(zhì)醇等指標(biāo)對(duì)武術(shù)運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)性疲勞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,研究發(fā)現(xiàn)血尿酸和皮質(zhì)醇主要是反映機(jī)體分解代謝功能的指標(biāo),而血睪酮為反映機(jī)體合成代謝功能指標(biāo),且均為反映外周疲勞的指標(biāo)。此外,其它關(guān)于運(yùn)動(dòng)性疲勞的監(jiān)測(cè)方面的研究也主要集中在外周疲勞的研究[9]。根據(jù)運(yùn)動(dòng)性疲勞發(fā)生的順序來(lái)看,首先發(fā)生的是運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞,因此尋找中樞疲勞的監(jiān)測(cè)指標(biāo),合理安排運(yùn)動(dòng)量,科學(xué)訓(xùn)練,減少傷病的發(fā)生是運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)界亟待解決的問(wèn)題。

MicroRNA(MiRNA)是一類小型非編碼 RNA,分布于多種動(dòng)植物中。多數(shù)MiRNA的基因結(jié)構(gòu)和功能呈現(xiàn)進(jìn)化保守性,通過(guò)與mRNA內(nèi)特定把序列互補(bǔ)配對(duì),在轉(zhuǎn)錄后或翻譯 2個(gè)水平上調(diào)控基因的表達(dá)[10],實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡、新陳代謝、以及病理過(guò)程的調(diào)節(jié)[11]。MiRNA在生物發(fā)育的不同階段、細(xì)胞和組織中表達(dá)的類型不同[12],且血清中的 miRNA不會(huì)被 RNase降解,極端情況下,血清中的miRNA仍有極好的穩(wěn)定性;且只有種系差異無(wú)個(gè)體差異,而且在血清和血漿中,同一種miRNA的檢測(cè)結(jié)果具有良好相關(guān)性,說(shuō)明外周血miRNA具有良好的生物標(biāo)記檢測(cè)的潛質(zhì)。

Bcl-w蛋白是抗凋亡 bcl-2家族中的成員,大量研究發(fā)現(xiàn)microRNA在神經(jīng)系統(tǒng)缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的凋亡中起到一定的的作用[13]。李朝暉研究發(fā)現(xiàn), microRNA-422a參與了凋亡過(guò)程,且可能通過(guò)調(diào)節(jié)bcl-w蛋白的表達(dá)來(lái)發(fā)揮促凋亡的作用,且兩者呈負(fù)相關(guān)。力竭運(yùn)動(dòng)過(guò)程中同樣存在運(yùn)動(dòng)性腦缺血,在恢復(fù)階段又存在再灌注,運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)界將此現(xiàn)象稱作運(yùn)動(dòng)性腦缺血再灌注。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn),大腦皮質(zhì)內(nèi)Bcl-w的表達(dá)與外周血內(nèi)Mir-422a呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),即力竭運(yùn)動(dòng)后即刻Mir-422a表達(dá)降低 (P<0.05),而Bcl-w表達(dá)升高 (P<0.05);12h后Mir-422a表達(dá)逐漸升高,而Bcl-w表達(dá)逐漸降低,24h基本恢復(fù)到安靜水平。因此,我們推測(cè),Mir-422a可能參與了運(yùn)動(dòng)性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的凋亡。

4 結(jié)論

細(xì)胞凋亡是運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞的發(fā)生機(jī)制之一,外周血內(nèi)Mir-422a的表達(dá)有望作為運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

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The Relationship Between the Expression ofM ir-422a in Peripheral Blood
and Bcl-w in Cerebral Cortex and Exercise-Induced Central Fatigue

Yang L i

(College of Physical Education,NorthwestUniversity forNationalities,Lanzhou 730030)

Objective:To explore whetherMir-422a can monitor exercise-induced central fatigue.Methods:36 healthymaleW ister rats are randomly divided into the control group(group C)and the exhaustive group(group E). The expression of Mir-422a in peripheral blood and Bcl-w in cerebral cortex is tested by real-time PCR and immunohistochemistry immediately,12 hours and 24 hours after the exhaustive exercise.Results:The expression ofMir -422a dropswhile the expression ofBcl-w jumps immediately after the exercise(P<0.05);the expression ofMir-

422a gradually increaseswhile the expression ofBcl-w gradually decreases 12 hours after the exercise;the expression of the two both regain the previous level 24 hours after the exercise.Conclusion:The expression ofMir-422a in the peripheral blood is likely to be the index to monitor exercise-induced central fatigue.

exercise-induced fatigue,exhaustive s wimming,Mir-422a,Bcl-w

G804.2

A

1001—9154(2010)09—0069—03

book=69,ebook=148

G804.2

A

1001—9154(2010)09—0069—03

楊立:(1969—)內(nèi)蒙古阿拉善左旗人,碩士,副教授,研究方向:足球教學(xué)及運(yùn)動(dòng)性疲勞相關(guān)研究。

2010—07—13