彭素梅 李洪波

四環(huán)素是從放線菌金色鏈叢菌(streptomyces aureofaciens)的培養(yǎng)液等分離出來的抗菌物質(zhì)，對革蘭陽性菌、陰性菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體屬乃至原蟲類都有很好的抑制作用，是一種廣譜抗菌素。對于四環(huán)素效價(jià)的測定，《中國藥典))2005年版采用管碟法［1］。管碟法操作繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長，影響因素多，重現(xiàn)性差，采用濁度法測定可克服以上不足［2］。本文建立了利用濁度法測定四環(huán)素片效價(jià)的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 WBS-100全自動(dòng)微生物比濁法測定儀及石英培養(yǎng)杯(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司)，R200D電子天平(德國Sartorius公司)。

1.2 菌株、樣品、培養(yǎng)基及試劑 金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］由中國藥品生物制品檢定所提供;四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品(批號:130306-200317，970 μg/mg)由中國藥品生物制品檢定所提供;四環(huán)素片(批號:0806007;0808011;0810012)由北京康蒂尼藥業(yè)有限公司提供。

抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(pH6.5，批號070603)由北京三藥科技開發(fā)公司提供;抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ號(pH7.0，批號070105)由北京三藥科技開發(fā)公司提供;滅菌0.9%氯化鈉溶液和磷酸鹽緩沖溶液(pH6.0)均按中國藥典2005年版二部附錄3配制。其他試劑均為分析醇。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌液的配制取 金黃色葡萄球菌斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，置35℃ ～37℃培養(yǎng)18～22 h，用滅菌生理鹽水洗下菌苔，加生理鹽水稀釋，使其在530 nm波長處的吸光度約為1.0。取菌液0.3 ml加至100 ml抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ中，搖勻，為實(shí)驗(yàn)菌液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液的配制 精密稱取四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品26.20 mg，置25 ml量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定容，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。用磷酸鹽緩沖溶渡(pH6.0)按劑距比 1.5∶1 進(jìn)一步稀釋成 0.06、0.09、0.13、0.2、0.3 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 供試品溶液的配制 取四環(huán)素片樣品10片，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于紅霉素100 mg)，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解后，室溫密閉放置過液，精密量取上清液，作為供試品貯備溶液。試驗(yàn)時(shí)精密四環(huán)素片儲備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH6.0)稀釋成0.2和0.1 μg/ml的供試品溶液。

2.4 培養(yǎng)與測定 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定。取系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液各1.0 ml，按拉丁方排列分別加入滅菌培養(yǎng)管中，再加入實(shí)驗(yàn)菌液9.0 ml，置微生物比濁法測定儀內(nèi)，于37℃培養(yǎng)。另取稀釋溶劑1.0 ml，加9.0 ml空白培養(yǎng)基，混勻，作為空白對照。儀器在位于530 nm波長處測定各管金黃色葡萄球菌對數(shù)生長期內(nèi)小同培養(yǎng)時(shí)間下的吸光度值(A)。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法汁算供試品的效價(jià)值。

3 結(jié)果

3.1 線性實(shí)驗(yàn) 在0.05～0.33 μg/ml范圍內(nèi)做線性實(shí)驗(yàn)。分別精密苗取上述四環(huán)素系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1.0 ml，置滅菌比色皿中，每個(gè)濃度5管，分別加入實(shí)驗(yàn)菌液9.0 ml，立即搖勻，置抗生素比濁法測量儀內(nèi)，于(37±1)℃培養(yǎng)4 h，在530 nm處測定吸收度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，抗生素濃度在0.06～0.3 μg/ml時(shí)，吸光度值A(chǔ)與抗生素濃度對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=bX+a=-0.3002X-0.0316(相關(guān)系數(shù)r=0.9968)，在此范圍內(nèi)可設(shè)計(jì)用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定四環(huán)素的含量。

3.2 回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密量取四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品加入到已測定濃度的四環(huán)素片樣品溶液中，加0.1 mol/L鹽酸溶液配制成濃度為0.08、0.10及0.12 μg/ml混合溶液各3份，按2.4方法測定回收率。平均回收率為99.22%(n=9)，RSD=1.7%。結(jié)果見表1。

表1 四環(huán)素片加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表2 比濁法與管碟法測定四環(huán)素效價(jià)的結(jié)果比較

3.3 與管碟法的比較 取3批四環(huán)素片樣品按2.4方法和中國藥典2005年版二部四環(huán)素片含量測定項(xiàng)下管碟法測定其效價(jià)，將結(jié)果進(jìn)行比較，見表2。

4 討論

中國藥典2005年版二部收載四環(huán)素效價(jià)測定采用管碟法［1］。管碟法能直觀反應(yīng)樣品的體外抗菌能力，一直被廣泛應(yīng)用。但因其操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長，影響因素多，濁度法可以克服管碟法的不足，且根據(jù)我科室采用兩種方法比較，濁度法與管碟法結(jié)果基本一致。

但濁度法也應(yīng)注意操作的規(guī)范性，如菌液培養(yǎng)時(shí)間的一致性，主要是使每管的培養(yǎng)時(shí)間相等，實(shí)驗(yàn)時(shí)在試管中加入含試驗(yàn)菌液的培養(yǎng)基后，應(yīng)立即加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，混合均勻;濁度法對試驗(yàn)儀器的性能要求較高，主要體現(xiàn)在培養(yǎng)室的溫度偏差，要求培養(yǎng)溫度一致;另外比色管的清潔度也會給測定結(jié)果帶來影響。但濁法快速、易于操作，采用液體培養(yǎng)基，消除了多組分抗生素在固體培養(yǎng)基中擴(kuò)散不同的影響，使得試驗(yàn)的靈敏度高，精密度和準(zhǔn)確度都較瓊脂擴(kuò)散法好。而且用同定波長測定菌液的吸光度其精密度優(yōu)于管碟法中對抑菌圈的測定。

［1］國家藥典委員會，中國藥典(二部)．化學(xué)工業(yè)出版社，2005．

［2］張治錟．抗生素藥品檢驗(yàn)．人民衛(wèi)生出版社，1987:80-97．