趙海欣 趙連中 鄧曉文 周明慧

黃芪為雙瓜糖安膠囊的君藥，其主要成分黃芪甲苷(AstragalosideⅣ)［1］，作為含量測定指標。本品執(zhí)行標準為國家藥品監(jiān)督管理局標準(試行)WS-5838(B-0838)-2002，采用薄層色譜掃描法測定黃芪甲苷的含量，該方法過程較復雜，靈敏度低，重現(xiàn)性差。本文參考有關文獻［2-13］，采用 HPLCELSD法對制劑中的黃芪甲苷進行了含量測定方法的研究。通過方法學的系統(tǒng)考察和四批樣品的含量測定，建立了本品中該成分的含量測定方法。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 LC-10AT VP色譜系統(tǒng)(日本島津)，Varian 380-LC型ELSD 系統(tǒng)，Agilent-C18 色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，AS230自動進樣器(依利特)，CA-3型靜音無油空氣油泵(武漢科林普豐儀器有限公司)，AG135型萬分之一/十萬分之一電子天平(METTLER TOLEDO)，B5200S-DT超聲波清洗器(BRANSON);正丁醇為分析純，甲醇、乙腈為色譜純，水為純化水;黃芪甲苷對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，含量測定用(批號:110781-200613)。

1.1.2 樣品來源與處理 試驗用四批雙瓜糖安膠囊均為廣西桂西制藥有限公司生產，其批號分別為:090502，090503，090504，090505;黃芪及其他藥材均購自鹽城市健民藥店，經鑒定均為《中國藥典》正品。

1.2 方法

1.2.1 樣品液的制備 對照品溶液的制備精密稱取置五氧化二磷干燥器中減壓干燥12 h以上的黃芪甲苷對照品9.48 mg，置25 ml容量瓶中，加入適量的甲醇，超聲使溶解，加甲醇稀釋濃度為0.3792 mg/ml的對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 取供試品20粒，研勻并稱取5.0155 g，置三角瓶中，加甲醇25 ml，超聲提取30 min，過濾，殘渣加40 ml水，用正丁醇萃取 4次(20，20，20，10 ml)。合并正丁醇萃取液，用氨試液洗滌2次(40，40 ml)，棄去氨試液，再用正丁醇飽和的水洗滌2次(20，20 ml)，將正丁醇液水浴蒸干，殘渣以適量的甲醇溶解，過0.45μm微孔濾膜定容于2 ml容量瓶中，作為供試品溶液。

1.2.3 陰性對照品溶液的制備 除去黃芪藥材，按處方量比例稱取其他各組分，按供試品的制備工藝制成黃芪甲苷陰性對照品，并按上述供試品溶液的制備方法制得陰性對照品溶液2 ml。

1.2.4 色譜條件 色譜柱為Agilent-C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm);流動相為乙腈-水(30:70);蒸發(fā)光散射檢測器;流速1.60L/min;蒸發(fā)管溫度90℃;霧化器溫度 50℃;柱溫35℃。

1.2.5 系統(tǒng)適用性試驗 試驗結果表明，陰性對照品溶液的圖譜在黃芪甲苷峰位置處無假陽性峰，黃芪甲苷的保留時間約為12.589 min，且與相鄰的峰分離度為2.5，柱效按黃芪甲苷計為5836。

圖1 對照品溶液和供試品溶液的高效液相色譜圖

1.2.5 線性關系考察 配制10.42、20.84、41.68、69.47、104.20、156.30、208.40 μg/ml的黃芪甲苷溶液，分別注入液相色譜儀，記錄峰面積;以黃芪甲苷峰面積的自然對數(shù)(lnA)為縱坐標，進樣濃度的自然對數(shù)(lnC)為橫坐標，得回歸方程lnA=1.5461lnC+5.9564，r=0.9995(n=6);結果(圖 2)表明，當進樣量在0.8336～10.4200μg范圍內時，黃芪甲苷對照品的進樣濃度的自然對數(shù)值與峰面積的自然對數(shù)值呈良好的線性關系，可以用外標法測定并計算供試品中黃芪甲苷的含量。

圖2 黃芪甲苷對照品線性回歸曲線

1.2.6 精密度試驗 取黃芪甲苷對照品溶液，按上述色譜條件進樣20 μL，連續(xù)測定6次，記錄黃芪甲苷峰面積，求得相對標準偏差RSD為0.613%，表明儀器精密度良好。結果

見表1。

表1 精密度試驗結果

1.2.7 穩(wěn)定性試驗 取上述供試品溶液，分別放置0、2、4、8、10、12 h后，依法操作測定黃芪甲苷峰面積，求得相對標準偏差RSD為0.163%，表明黃芪甲苷在12 h內穩(wěn)定性良好。結果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結果

1.2.8 重復性試驗 取同一批供試品6份，按上述供試品溶液的制備方法配制溶液，并按上述色譜條件進樣20 μL，記錄黃芪甲苷峰面積，求得相對標準偏差RSD為0.291%，表明測定方法的重復性良好。結果見表3。

表3 重復性試驗結果

1.2.9 加樣回收率試驗 制備黃芪甲苷對照品0.1012 mg/ml的溶液。取1.0 ml(含0.1012 mg的黃芪甲苷)，在水浴上揮干溶劑。取已知含量的供試品(批號:20090502)35粒內容物(含量為0.0383 mg/g)，研細，約3g，精密稱定5份，置具塞錐形瓶中，照供試品溶液的制備方法配制溶液，依法測定，平均回收率為100.39%。結果見表4。

1.2.10 樣品的測定 取不同批號的雙瓜糖安膠囊各一份，記錄色譜圖。每批供試品溶液測定3次，以測得的峰面積的自然對數(shù)值取平均值按外標法計算含量。結果見表5。

2 結果

2.1 提取溶劑 以水為提取溶劑時譜圖中雜質峰較多，而以流動相為提取溶劑時幾乎無峰面積產生，所以本試驗參照中國藥典黃芪藥材的提取方法，選擇甲醇作為提取溶劑。

2.2 提取方法 水浴加熱回流提取率較低，而超聲的提取率顯著提高。鑒于超聲的方法更簡便，本試驗采取超聲為提 取方法。

表4 加樣回收率考察結果

表51 供試品中黃芪甲苷的含量測定結果

2.3 提取時間 超聲提取20 min黃芪甲苷的含量明顯小于30 min，提取30 min與40 min的含量無明顯差異，故以超聲提取30 min作為供試品提取方法。

3 討論

3.1 樣品前處理方法研究 分別比較了正丁醇的提取次數(shù)及用量，結果表明提取3次，20 ml為最佳方法。此外，試驗中采用了氨試液對供試品進行處理，從而明顯增加黃芪甲苷的量。

3.2 與原試行標準中規(guī)定的處理方法相比 我們采用HPLC-ELSD法對過樹脂柱處理的樣品與未過樹脂柱處理的樣品進行了比較，結果表明二種方法色譜圖基本一致。

3.3 陰性對照品的選擇 供試品雙瓜糖安膠囊為多成分提取制得的中藥復方制劑，其處方組成中苦瓜干、山藥等均含有皂苷類物質。為排除非黃芪甲苷類雜質的干擾，本試驗依據(jù)處方量比例稱取除黃芪藥材以外的其他各組分，按供試品的制備工藝制成黃芪甲苷陰性對照品。

3.4 檢測器的選擇 由于黃芪甲苷僅在紫外200 nm左右波長處有弱的末端吸收，響應值很小，用紫外檢測器檢測，靈敏度低，方法可操作性差［14］。蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)是近幾年應用在色譜方面的新型檢測器，為質量通用型檢測器［15］，它的響應值取決于被測物質顆粒的數(shù)量和大小。HPLC-ELSD法在各類中藥材質量標準制定、中藥指紋圖譜規(guī)范研究以及中藥新藥質量標準和穩(wěn)定性等領域將顯示很好的潛力。

3.5 ELSD檢測器影響因素 漂移管的溫度對噪音的影響并沒有明顯規(guī)律，氣體流速對響應值的影響是流速越大，粒子越小，散射光越弱，從而響應值越小。但流速降低，響應值變大，噪音也隨之增大［16］。最優(yōu)的流速是在可接受噪音的基礎上，產生最大響應值的最低氣體流速。ELSD的載氣若采用壓縮機輸出空氣，則應注意實驗室的濕度。

3.6 測定黃芪甲苷含量 將峰面積與對照品的濃度分別取自然對數(shù)后在一定范圍內可得到理想的線性關系(r=0.9995)。這種現(xiàn)象與蒸發(fā)光散射檢測器的檢測機制一致［17］。

4 小結

該文不但參考了大量文獻資料，而且在資料提供的方法基礎上做了大量的試驗工作，通過試驗提供的數(shù)據(jù)，驗證了該方法的可行性，可以作為改進雙瓜糖安膠囊中黃芪甲苷含量測定質量標準的參考。

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