趙永峰 蘇麗萍 鄭美婧 段靜靜

非霍奇金淋巴瘤治療的主要方法是化療?；煼椒ǖ倪x擇于淋巴瘤的組織病理學(xué)及與之相關(guān)聯(lián)的化療前預(yù)后風(fēng)險的評估。盡管近30年來，非霍奇金淋巴瘤患者的生存率提高了30%以上且大多數(shù)的患者都達(dá)到了原發(fā)緩解，但目前的治療方法仍無法讓人滿意。非霍奇金淋巴瘤治療失敗的原因是多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)。

MDR是指由一種藥物誘發(fā)，但同時又對其他多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制迥異的抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥［1］。乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)是近年發(fā)現(xiàn)的一種耐藥相關(guān)蛋白，與P-糖蛋白和多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)同屬ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，其過表達(dá)使腫瘤細(xì)胞對蒽環(huán)類藥物、羥基喜樹堿等產(chǎn)生抵抗［2］。Patel等［3］的研究表明:COX-2 可以上調(diào) P 糖蛋白的表達(dá)。在對卵巢癌及乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)COX-2與P糖蛋白的表達(dá)明顯相關(guān)［4，5］。臨床及實驗數(shù)據(jù)表明COX-2抑制劑的使用有助于提高癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性［6-9］。目前，在非霍奇金淋巴瘤關(guān)于COX-2和BCRP在多藥耐藥方面的研究報道較少，本實驗通過對61例非霍奇金淋巴瘤患者COX-2蛋白及、BCRP基因表達(dá)及治療反應(yīng)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集本院2008年9月至2009年7月收治的61例NHL患者，男35例，女26例，年齡18～81歲，中位年齡54歲。所有患者均經(jīng)過病理切片形態(tài)觀察、免疫組化確診，病理分型按2001年WHO腫瘤分類，其中含56例B細(xì)胞淋巴瘤，5例T細(xì)胞淋巴瘤。依據(jù)Ann Arbor系統(tǒng)對疾病的臨床進(jìn)展分類，I/II期36例，III/IV期25例。所有患者均接受6-8個療程的R-CHOP方案化療，其中31例化療敏感，30例化療耐受。在對數(shù)據(jù)分析時，依據(jù)IPI評分標(biāo)準(zhǔn)分為4組:低危組、中低危、中高危組以及高危組。10例反應(yīng)增生性淋巴結(jié)炎作為陰性對照組。

1.2 設(shè)備及儀器 主要檢測儀器:Perkin Elmer公司lamddaBio10型紫外分光光度計，PE2400型。PCR擴(kuò)增儀，Gene公司GDS-8000PCA凝膠成像分析系統(tǒng)。試劑:鼠抗人COX-2抗體及DAB顯色試劑盒均購于北京中山公司，SP免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。Trizol為Gibco產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega公司。BCRP上游引物:5’-AGATCAGCTACACCACCTCC-3’，下 游 引 物:5’-ACCCCGAACACCTTCTTA-3’，產(chǎn)物長度791bp;β-actin上游引物5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’: 下 游 引 物:5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，產(chǎn)物長度1359bp。

1.3 免疫組化 所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚度切片。SP法染色步驟嚴(yán)格按照SP試劑盒說明進(jìn)行。已知COX-2陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果判定:COX-2主要于淋巴瘤瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)，計數(shù)高倍視野下1000個以上腫瘤細(xì)胞中陽性腫瘤細(xì)胞所占的百分比，以陽性細(xì)胞計數(shù)＞10%判定為COX-2表達(dá)陽性。

1.4 RT-PCR 手術(shù)獲得淋巴結(jié)標(biāo)本后立即放入液氮或-70℃低溫冰柜中保存。所有標(biāo)本均經(jīng)臨床病理證實TRIZOL提取法提取細(xì)胞總RNA紫外線分光光度計定量RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為CDNA。BCRP基因PCR條件:用β-actin作內(nèi)參照，按RNA PCR Kit(AMV)試劑盒說明書操作。反應(yīng)總體積為25μL，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min;94℃ 30 s，55℃30 s，72℃1 min，共 35 個循環(huán);最后一循環(huán)于72℃5 min。取15μL產(chǎn)物用MCF一7/ADR做陽性對照進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，將結(jié)果掃描、照象。同時，實驗設(shè)陽性對照組:乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR中BCRPmRNA的表達(dá)作為陽性對照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)有意義。

2 結(jié)果

2.1 COX-2蛋白和BCRP mRNA在非霍奇金淋巴瘤中的表達(dá) COX-2蛋白在非霍奇金淋巴瘤中的陽性表達(dá)率為50.8%，BCRP基因在非霍奇金淋巴瘤中的陽性表達(dá)率為45.8%，COX-2蛋白與BCRP基因在NHL的表達(dá)與對照組相比，差異有顯著性，(P＜0.05)。

2.2 COX-2蛋白和BCRP mRNA在NHL中表達(dá)的相關(guān)性在31例COX-2蛋白表達(dá)陽性的NHL患者中，BCRP mRNA陽性表達(dá)20例，而30例在COX-2陰性表達(dá)的NHL患者中，BCRP mRNA陽性表達(dá)僅8例。經(jīng)檢驗COX-2蛋白和BCRP mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)，χ2=8.795，r=0.355，P＜0.05。

2.3 COX-2蛋白和BCRP mRNA的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系COX-2和BCRP在NHL中的表達(dá)與臨床特征如年齡、性別、IPI、LDH、β2-微球蛋白等無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，而與Ann Arbor分期 III/IV明顯相關(guān)(P＜0.05)，見表1。

表1 COX-2蛋白和BCRP mRNA在NHL中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

3 討論

我們研究了非霍奇金淋巴瘤患者COX-2蛋白和BCRP mRNA的表達(dá)，并對這些因子的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的潛在的相關(guān)性進(jìn)行了分析。在50.8%的非霍奇金淋巴瘤病例中發(fā)現(xiàn)有COX-2的表達(dá);在45.8%的病例中發(fā)現(xiàn)有BCRP的表達(dá)。

環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase，COX)是前列腺素合成過程中一個重要的限速酶。人體環(huán)氧化酶主要有兩種異構(gòu)體:COX-1和COX-2。COX-1為結(jié)構(gòu)型酶，在機(jī)體中穩(wěn)定表達(dá)，維持機(jī)體正常生理功能。COX-2是花生四烯酸代謝過程中的一個關(guān)鍵酶，在正常組織中表達(dá)陰性或弱陽性，但在細(xì)胞受到各種致癌物刺激后表達(dá)上調(diào)。COX-2的過度表達(dá)促進(jìn)了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展(結(jié)腸癌，食道癌，胃癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，皮膚癌，前列腺癌［10-17］，COX-2具有抗凋亡和促進(jìn)腫瘤血管生成的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)COX-2還可能具有調(diào)控腫瘤多藥耐藥的作用，是惡性腫瘤重要的預(yù)后不良因素之一。本實驗中，在50.8%的非霍奇金淋巴瘤病例中發(fā)現(xiàn)有COX-2的表達(dá)，提示其在非霍奇金淋巴瘤發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，這與其他的一些惡性腫瘤相似。在這項研究中，腫瘤細(xì)胞COX-2的過度表達(dá)與非霍奇金淋巴瘤患者的臨床和/或病理學(xué)數(shù)據(jù)之間沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。

乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)是與藥物泵出有關(guān)的ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族中又一新的成員，首先由于Doyle等［18］1998年從有耐藥現(xiàn)象，但無P蛋白以及MRP1表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR發(fā)現(xiàn)的一種新的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白可將多種化合物從細(xì)胞內(nèi)排出。Yoh等［19］采用免疫組化方法檢測72例確診為ⅢB和Ⅳ期非小細(xì)胞性肺癌的老年人的腫瘤標(biāo)本中BCRP蛋白的表達(dá)，陽性率為46%。與順鉑為主的聯(lián)合化療療效的相關(guān)性分析提示，BCRP陰性者與BCRP陽性者有效率不同，兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.08)。在本實驗中，我們的研究已經(jīng)證明了BCRP在非霍奇金淋巴瘤的表達(dá)與臨床效應(yīng)之間存在正相關(guān)。同時，我們觀察到BCRP與COX-2在非霍奇金淋巴瘤表達(dá)明顯相關(guān)，提示 COX-2在BCRP介導(dǎo)的非霍奇金淋巴瘤多藥耐藥中可能發(fā)揮重要作用。

總之，COX-2與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白BCRP之間的正相關(guān)，對于開展將COX-2抑制劑運(yùn)用于提高非霍奇金淋巴瘤的化療敏感性的遠(yuǎn)期臨床調(diào)查打下基礎(chǔ)。應(yīng)用相對價廉的COX-2抑制劑可能在很大程度上提高非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞對化療的敏感性。既然BCRP的表達(dá)與臨床反應(yīng)相關(guān)，那么ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體似乎參與了非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的初始耐藥。BCRP作為非霍奇金淋巴瘤患者化療反應(yīng)和復(fù)發(fā)危險性的預(yù)測因子，在臨床上有潛在的應(yīng)用價值。

［1］Ricardo P．Multidrug resistance retrospect and prospects in anticancer drug treatment．Curr Med Chem，2006，33:1859．

［2］Bailey J，Hassel A，Ross D，et al．Promoter characterization and genomic organization of the human breast cancer resistance protein(ATP-binding cassette transporter G2 gene)．Biochem Biophy Acta，2001，1520(3):234-241．

［3］Patel VA，Dunn MJ and Sorokin A:Regulation of MDR-1(P-glycoprotein) by Cyclooxygenase-2． JBiolChem，2002，77:38915-38920．

［4］Surowiak P，Materna V，Denkert C，Kaplenko I，Spaczynski M，Dietel M，Zabel M and Lage H:Significance of cyclooxygenase2 and MDR1/P-glycoprotein coexpression in ovarian cancers．Cancer Lett，2006，35:272-280．

［5］Surowiak P，Materna V，Matkowski R，Szczuraszek K，Kornafel J，Wojnar A，Pudelko M，Dietel M，Denkert C，Zabel M and Lage H:Relationship between cyclooxygenase 2 and P-glycoprotein expressions in invasive breast cancers and their prognostic significance．Breast Cancer Res，2005，862-R870．

［6］Gasparini G，Longo R，Sarmiento R et al．Inhibitor of cyclooxygenase 2:a new class of anticancer agents Lancet Oncol，2003，4:605-615．

［7］Kim SK，Lim SY，Wang KCh，et al．Overexpression of cyclooxygenase-2 in childhood ependymomas:role of COX-2 inhibitor in growth and multi-drug resistance in vitro．Oncol Rep，2004，12:403-409．

［8］Ratnasinghe D，Daschner PJ，Anver MR，et al．Cyclooxygenase-2，P-glycoprotein-170 and drug resistance;is chemoprevention against multi-drugresistance possible? AnticancerRes，2001， 21:2141-2147．

［9］Ziemann Ch，Schfer D，Rüdell G，Kahl GF and Hirsch-Ernst KI．The cyclooxygenase system participates in functional Mdr1b over expression in primary rat hepatocyte cultures．Hepatology，2002，35:579-588．

［10］Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al．COX22 is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors．Cancer，2000，89(12):2637-2645．

［11］韓正祥，張敬川，王琳，等．環(huán)氧化酶22的表達(dá)與乳腺癌生物學(xué)行為的相關(guān)性．徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，24(1):32-34．

［12］Denkert C，Winzer K J，Muller BM，et al．Elevated expression of cyclooxygenase22 is a negative prognostic factor for disease free survival and overall survival in patients with breast carcinoma．Cancer，2003，97:2978-2987．

［13］Ristim?ki A，Nieminen O，Saukkonen K，et al．Expression of cyclooxygenase-2 in human transitional cell carcinoma of the urinary bladder．Am J Pathol，2001，158:849-853．

［14］Eberhart CE，Coffey RJ，Radhika A，et al．Up-regulation of cyclooxygenase-2 gene expression in human colorectal adenomas and adenocarcinomas．Gastroenterology，1994，107:1183-1188．

［15］Kargman SL，O’Neill GP，Vickers PJ，et al．Expression of prostaglandin G/H synthase-1 and-2 in human colon cancer．Cancer Res，1995，55:2556-2559．

［16］Tiemann M，Schrader C，Klapper W，et al．Histopathology，cell proliferation indices and clinical outcome in 304 patients with mantle cell lymphoma MCL):a clinic-pathological study from the European MCL Network．Br J Haematol，2005，131:29-38．

［17］Tucker ON，Dannenberg AJ，Yang EK，et al．Cyclooxygenase-2 expression is up regulated in human pancreatic cancer．Cancer Res 1999，59:987-990．

［18］Doyle LA，Yang WD，Abruzzo LV．et al．A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells．Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(26):665-670．

［19］Yoh K，Ishii G．Yokose T，et al．Breast cancer resistance protein impacts clinical outcome in platinum-based chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer．clinic cancer Res，2004，10(5):1691-1697．