吳晶晶 樊慧杰 王貴吉

結(jié)直腸癌是危害人類健康最嚴(yán)重的疾病，侵襲和轉(zhuǎn)移是它的重要特征，也是患者死亡的重要原因［1］。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常是多種疾病發(fā)生的分子基礎(chǔ)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。Smad7是Smads家族的重要成員，而TGF-β1作為一種多功能的細(xì)胞因子，其介導(dǎo)的信號(hào)通路與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化技術(shù)對(duì)結(jié)直腸癌中Smad7和TGF-β1蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析，探討其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 臨床材料 收集2003年1月至2005年在我院行結(jié)直腸癌手術(shù)后存檔的標(biāo)本，共140例，其中男86例，女54例，年齡34～75歲，平均56.9歲。患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療，臨床資料完整。選取同期結(jié)腸癌術(shù)后切緣正常結(jié)腸組織70例作為對(duì)照組。二組在性別、年齡、體重及病程等相關(guān)因素比較中，差別無(wú)顯著差異，具有可比性。

1.2 檢測(cè)方法 Smad7和TGF-β1均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)蛋白的表達(dá)。主要步驟:脫蠟，水化組織切片，3%H2O2去離子水孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;抗原修復(fù)后分別滴加一抗，室溫37℃孵育1～2 h或過(guò)夜，PBS沖洗，5 min×3次;滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫37℃孵育20 min，PBS沖洗，5 min×3次;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，室溫37℃孵育20～30 min，PBS沖洗，5 min×3次;應(yīng)用DAB顯色劑顯色;自來(lái)水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.3 結(jié)果判定方法 結(jié)果均由二位病理病主治醫(yī)師閱片得出。Smad7和TGF-β1的陽(yáng)性信號(hào)均為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，合并計(jì)算高倍鏡下(×400)隨機(jī)選擇的10個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞占全部計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞的百分率，平均每個(gè)視野細(xì)胞漿呈陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)≥10%為陽(yáng)性，無(wú)明顯陽(yáng)性反應(yīng)或陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)及相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Smad7和TGF-β1在結(jié)直腸癌、正常結(jié)腸黏膜組織的表達(dá) Smad7和TGF-β1在結(jié)直腸癌中表達(dá)的陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組，見表1。

2.2 Smad7和TGF-β1的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 Smad7和TGF-β1在結(jié)直腸癌中表達(dá)的陽(yáng)性率與浸潤(rùn)深度、Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。見表2。

表1 Smad7和TGF-β1在結(jié)直腸癌、正常結(jié)腸黏膜組織的表達(dá)(例，%)

表2 Smad7和TGF-β1在結(jié)直腸癌中不同臨床病理特征的表達(dá)比較(例，%)

2.3 結(jié)直腸癌中Smad7和TGF-β1表達(dá)的關(guān)系 Smad7和TGF-β1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.38，P＜0.05)。而在正常結(jié)腸黏膜中Smad7和TGF-β1的表達(dá)未見相關(guān)性(P＞0.05)。

3 討論

Smad蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的TGF-β家族受體激酶的關(guān)鍵作用底物，廣泛分布在果蠅及各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，其可分為三類:①受體激酶激活的Smad蛋白，作為TGF-β家族受體激酶的直接底物;②輔助型或共同介導(dǎo)的Smad，主要通過(guò)同第一類相連，參與到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中;③抑制性或拮抗性Smad，通過(guò)阻斷受體激活第一類Smad，抑制其他兩類底物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［2］。Smad7是屬于抑制性 Smad，可以有效地與活化的TGFβRI相互作用，影響受體調(diào)節(jié)性Smad與TGFβR的結(jié)合，從而影響負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)向核內(nèi)的傳遞。TGF-β1通過(guò)受體及Smad通路激活核內(nèi)自身啟動(dòng)子，誘導(dǎo)內(nèi)源性TGF-β1的表達(dá)，形成反饋環(huán)路［3］。張勇等［4］通過(guò)對(duì)50例鼻咽癌患者應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)Smad7和TGF-β1的表達(dá)，認(rèn)為二者具有正相關(guān)性，對(duì)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有重要價(jià)值。

本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌中Smad7和 TGF-β1的表達(dá)，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌中 Smad7和TGF-β1的表達(dá)明顯低于正常結(jié)腸黏膜組織，提示Smad7和TGF-β1參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生過(guò)程。Smad7和TGF-β1的表達(dá)與結(jié)直腸癌的浸潤(rùn)深度、Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Smad7和TGF-β1參與了腫瘤的發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，由于這個(gè)三個(gè)指標(biāo)均與患者的預(yù)后有關(guān)，因此，聯(lián)合檢測(cè)其表達(dá)可能為重要的預(yù)后指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Smad7和TGF-β1具有正相關(guān)，提示二者可能有協(xié)同作用。Smad7是TGF-β1信號(hào)通路的抑制因子，可負(fù)反饋調(diào)節(jié)TGF-β1信號(hào)反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，Smad7表達(dá)異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞對(duì)TGF-β1的應(yīng)答紊亂，從而在某些細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中起推動(dòng)作用。有觀點(diǎn)認(rèn)為Smad7和TGF-β1通路主要有三個(gè)步驟:①TGF-β1超家族信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo);②TGF-β1超家族的細(xì)胞漿內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);③TGF-β1超家族的細(xì)胞核內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［5］。TGF-β1與其相應(yīng)受體、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad7共同組成了一個(gè)影響腫瘤形成和發(fā)展的通路，通路中任何一個(gè)組成元件發(fā)生紊亂，均可導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，影響其生物學(xué)效應(yīng)。

總之，結(jié)直腸癌中 Smad7和 TGF-β1低表達(dá)，Smad7和TGF-β1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有協(xié)同作用，聯(lián)合檢測(cè)二者的表達(dá)可能對(duì)判斷預(yù)后有重要價(jià)值。

［1］劉愛東，龐久玲．血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)及其意義．承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，23(2):132-134．

［2］白一彤，陳少夫，鄭宏，等．IFN-α對(duì)大鼠胰腺纖維化組織中Smad7及PDGF-B表達(dá)的影響．世界華人消化雜志，2009，17(21):2131-2136．

［3］龐久玲，馬征，劉軍，等．Smad3和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及正常皮膚中的表達(dá):48:40:40例標(biāo)本病理檢測(cè)．中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(11):1927-1930．

［4］張勇，秦娜，李祖云．TGF-β、TGF-β2和Smad7在鼻咽癌中的表達(dá)及意義．廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，25(4):517-520．

［5］陳駿，錢云良．TGF-β/Smads通路與增生性瘢痕肌成纖維細(xì)胞分化．中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2007，16(7):1000-1003．