杜亞豪，鄭月宏，田 翠，李匯華

腹主動脈瘤血管平滑肌細胞凋亡和自噬研究

杜亞豪，鄭月宏，田 翠，李匯華

目的 探討血管平滑肌細胞(SMC)凋亡和自噬與腹主動脈瘤(AAA)發(fā)病的關系。方法 采用原位末端DNA標記(TUNEL)技術觀察AAA和人正常主動脈組織中SMC凋亡的情況，并用免疫組織化學分析其中LC3的蛋白表達。提取AAA和正常主動脈組織RNA，采用RT-PCR方法檢測其中與自噬相關的基因Beclin1、Atg4b、Bnip3、Vps34的表達。結果 AAA組織中凋亡的SMC明顯高于正常主動脈組織(P＜0.05)；LC3蛋白在AAA中的表達高于正常主動脈組織(P＜0.05)；AAA中Beclin1、Atg4b、Bnip3、Vps34表達水平明顯高于正常主動脈組織(P＜0.05)。結論 SMC凋亡和自噬在AAA的發(fā)病中起重要作用。

主動脈瘤，腹；細胞凋亡；自噬；肌，平滑，血管

腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)是一種以腹主動脈局限性擴張為主的血管疾病，多見于65歲以上老年人，病死率較高。AAA的發(fā)病機制尚未明確，普遍的觀點認為是遺傳、環(huán)境、血流動力學和免疫等多種因素共同作用的結果。目前認為其發(fā)病的主要機制是主動脈細胞外基質的降解和中膜平滑肌細胞(smooth muscle cell，SMC)的減少。SMC是腹主動脈中膜的主要細胞，直接或間接地分泌彈力蛋白、膠原蛋白及其他基質蛋白，對于動脈彈力板層的構筑和修復起著十分重要的作用。細胞凋亡和自噬都是主動而有序的細胞自我消亡，SMC的凋亡和自噬與心血管系統(tǒng)生理病理重構密切相關。本研究通過檢測AAA與人正常主動脈組織SMC的凋亡情況，以及在mRNA和蛋白水平上檢測其中的細胞自噬情況，探討SMC的凋亡和自噬在AAA發(fā)病中的機制。

1 材料與方法

1.1 組織和試劑 10例AAA組織由北京協(xié)和醫(yī)院血管外科醫(yī)師術中獲取后提供，6例人正常主動脈組織取自健康非正常死亡尸體(死亡時間＜10 min)。在無菌、無RNA酶條件下，于平腎動脈下方約4 cm處切取主動脈壁，迅速凍存在液氮中備用。Trizol購自美國Invitrogen公司，LC3抗體購自美國R&D公司。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，T UNEL試劑盒購自瑞士Roche公司，RT-PCR試劑盒購自Qiangen公司。其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 組織凋亡染色 AAA和正常主動脈組織固定、包埋，制作石蠟切片 ，厚度4 μ m ，進行組織凋亡染色，操作程序嚴格按照T UNEL試劑盒說明書進行，DAB顯色，陽性細胞為細胞核中有棕色顆粒，呈散在分布。400倍光學顯微鏡下隨機計數(shù)6個視野，共約2000個細胞，計算每個視野陽性細胞的百分數(shù)后進行統(tǒng)計學分析。

1.3 免疫組織化學檢測LC3蛋白的表達 免疫組化試劑盒為中杉金橋PV-9000二步法檢測試劑，嚴格按照說明書操作，一抗用兔抗人LC3抗體，工作濃度為1∶1000；DAB顯色，蘇木素復染。顯微鏡下觀察棕黃色染色為陽性，用計算機彩色圖像分析系統(tǒng)分析每張切片上中膜免疫組化染色陽性細胞的染色強度(平均積分吸光度值)。

1.4 RT-PCR法半定量檢測 Beclin1、Atg4b、Bnip3、Vps34基因表達 嚴格按照按照 Trizol說明書提取AAA和正常主動脈組織總RNA，紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。逆轉錄過程按RT-PCR試劑盒說明書操作，PCR擴增循環(huán)參數(shù) Beclin1為94℃3 min，95℃30 s、60℃30 s、72℃30 s ，共 32個循環(huán)，72℃終延伸 10 min；Atg4b、Bnip3、Vps34 為 94℃3 min，95℃1 min、58℃1 min、72℃1 min，共 30個循環(huán)，72℃終延伸 10 min ；GADPH 為 94℃3 min，95℃1 min、59℃30 s、72℃30 s ，共 30個循環(huán)，72℃終延伸10 min，共28個循環(huán)，引物序列見表1，由上海生工生物技術有限公司合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照，以目的基因與內參對照的積分吸光度比值表示mRNA相對表達量。

表 1 Beclin1、Atg4b、Bnip3、Vps34及 GAPDH引物核苷酸序列

2 結 果

2.1 T UNEL染色及凋亡細胞計數(shù) T UNEL染色結果顯示，AAA組織中層組織中幾乎所有的SMC顯示出 TUNEL染色陽性；而正常主動脈中TUNEL陽性細胞很少(圖 1)。統(tǒng)計結果顯示，AAA組織中凋亡的SMC比例為(76.2±9.0)%，明顯比正常主動脈組織的(6.9±1.3)%高，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表2)。

表2 正常主動脈和AAA組織TUNEL染色陽性細胞的比例

圖1 正常主動脈組織(A)和AAA組織(B)平滑肌細胞(黑箭頭)(TUNEL染色，×400)

2.2 免疫組織化學 在AAA組織中LC3的表達明顯高于正常主動脈組織。AAA組織的陽性表達主要集中于中膜，在中膜染色呈深棕色，內膜和外膜也有一些陽性染色；而在正常主動脈組織中，內膜有較淺陽性染色，中膜和外膜幾乎未見陽性染色(圖2)。AAA組織中膜細胞陽性染色明顯比正常主動脈組織高(P＜0.05，表3)。

表3 正常主動脈和AAA組織中膜LC3的表達

2.3 RT-PCR RT-PCR結果可以看出，自噬相關基因在AAA組織中的含量明顯高于正常主動脈組織(圖 3)。Beclin1、Atg4b、Bnip3、Vps34在正常動脈組織中含量很少，而在AAA組織中含量較高，差異有顯著性(P＜0.05，表 4)。

圖 3 Beclin1、Atg4b、Bnip3、Vps34在正常主動脈和AAA組織中的表達

3 討 論

AAA具體發(fā)病原因至今未明，動脈中膜SMC密度降低是AAA主要病理特征之一。SMC丟失以及導致的細胞外基質合成減少使得腹主動脈結構嚴重受損，這是AAA形成中不可忽視的原因。Cailhier等[1]通過抑制胱天蛋白酶(caspase-3)抑制組織蛋白酶(cathepsin L)的釋放和細胞外基質的降解，證明了AAA的發(fā)病與細胞凋亡有一定的關系。Rowe等[2]觀察動脈瘤組織和正常主動脈組織，發(fā)現(xiàn)動脈瘤組織中的SMC密度低于正常主動脈組織。郭付有等[3]RT-PCR法檢測了顱內動脈瘤、AAA及正常主動脈中caspase-3的表達情況，發(fā)現(xiàn)AAA中的caspase-3含量明顯高于正常主動脈，這些結果說明中膜SMC凋亡與AAA形成有關。目前SMC凋亡發(fā)生的啟動因素及發(fā)生過程中確切的機制尚未清楚。筆者利用T UNEL染色可以看到，在AAA組織的中膜SMC上，陽性染色的細胞占了大多數(shù)，而正常主動脈組織中凋亡的細胞比例很小。進一步證明動脈SMC的凋亡導致中膜SMC密度降低，從而誘導AAA發(fā)病。

自噬是凋亡之外的程序性細胞死亡方式，在進化過程中高度保守。細胞自噬參與了絕大多數(shù)長半衰期蛋白質的降解[4]。近年來越來越多的研究提示相同誘導因素在不同細胞中可分別誘發(fā)自噬或凋亡。Terman等[5]通過研究發(fā)現(xiàn)心肌細胞自噬在心肌病中發(fā)揮一定作用。最新研究發(fā)現(xiàn)[6]，在動脈粥樣硬化中存在著血管SMC自噬，并且SMC自噬受到腫瘤壞死因子-α和胰島素樣生長因子-1的調節(jié)。LC3是哺乳動物細胞中酵母Atg8基因的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是細胞自噬泡膜的通用標志物，LC3修飾過程對自噬泡的形成必不可少[7]。本研究通過免疫組化發(fā)現(xiàn)LC3在AAA組織中膜SMC中呈陽性表達。說明AAA中存在著SMC自噬，導致中膜SMC的減少。

圖2 正常主動脈組織(A)和 AAA組織(B，黑箭頭)LC3免疫組化染色(×100)

表4 Beclin1、Atg4b、Bnip3、Vps34在正常主動脈和AAA組織中相對表達量

參與酵母自噬的相關基因Atg6在哺乳動物則稱為Beclin 1。有研究指出，Beclin 1-/-小鼠細胞自噬缺陷，凋亡正常，說明Beclin 1是自噬的調控基因[8]。Atg4b在自噬過程中起著較為重要的作用，Yoshimura等[9]用 RNA干擾技術證明，Atg4b與LC3密切相關。Bnip3屬于BH3-only亞家族，是HIF的下游應答基因之一。Bnip3可促進線粒體自噬[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在轉染了Bnip3的細胞中很早就出現(xiàn)了等離子膜通透孔、線粒體損害、過多的細胞質空泡和線粒體自噬現(xiàn)象[11]。Bnip3在缺氧和營養(yǎng)缺乏時促進細胞自噬的能力會有所增強[12]。最新研究發(fā)現(xiàn)，轉錄因子FoxO3引起了骨骼肌細胞的自噬過程。FoxO3控制著與自噬相關的 Bnip3和LC3基因轉錄，而Bnip3能調節(jié)FoxO3在自噬過程中所起的作用[13]。自噬小泡在形成過程中有3型PI3K復合體參與，這一復合體包括Vps34，Beclin 1和紫外線抵抗相關腫瘤抑制基因[14]。Ambra1可以通過與Beclin 1作用從而激活Vps34來刺激自噬過程。為此，本研究通過 RT-PCR發(fā)現(xiàn)，Beclin1、Atg4b、Bnip3、Vps34等自噬相關基因在AAA組織中表達水平高于正常主動脈組織，從而證實SMC自噬參與AAA發(fā)病過程。

另外，應認識到以下兩個問題：(1)AAA病理過程中SMC凋亡和自噬都導致SMC減少，因此對它們的比較研究可能比單一因素的研究更有意義。(2)應用AAA動物模型利于對主動脈SMC形態(tài)功能進行動態(tài)觀測，從而進一步研究 AAA發(fā)病的原因。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AAA的發(fā)病與SMC凋亡、自噬有密切關系。對于SMC凋亡和自噬這兩種細胞死亡方式的研究能為AAA發(fā)病提供理論依據(jù)。因此，應用藥物或基因治療的手段抑制SMC凋亡和自噬，并阻斷相關基因的表達，將是早期AAA治療中值得深入研究的方案。

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Apoptosis and autophagy of vascular smooth muscle cells of abdominal aortic aneurysm

DU Yahao，Z HENGY uehong，T IAN Cui，et al Insititute of Basic Medicine，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100730，China

Objective To investigate the relationship of apoptosis and autophagy of vascular smooth muscle cells(SMC)with the pathogenesis of abdominal aortic aneurysm(AAA).MethodsInsituterminal transferase-mediated dUTP nick end-labeling(TUNEL)was used to detect the apoptosis of SMC of AAA and human normal aorta.The expression of LC3 was measured by immunohistochemistry.RNA extraction from the tissue of AAA and human normal aorta was performed.The mRNA levels of autophagy-related genes Beclin1，Atg4b，Bnip3，and Vps34 are tested by RT-PCR.Results The number of TUNEL-positive SMC in AAA was higher than that in normal aorta(P＜0.05).The expression level of LC3 protein was significantly increased in AAA compared with that in normal aorta(P＜0.05).The mRNA expression levels of Beclin1，Atg4b，Bnip3 and Vps34 were markedly up-regulated in AAA compared with that in normal aorta(P＜0.05).Conclusion The apoptosis and autophagy of vascular SMC play an important role in the pathogenesis of AAA.

aortic aneurysm，abdominal；apoptosis；autophagy；muscle，smooth，vascular

R363.2

A

1671-5403(2010)03-05

100730北京市，中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所(杜亞豪、田翠、李匯華)；100730北京市，北京協(xié)和醫(yī)院血管外科(鄭月宏)

李匯華 ，Tel：010-65296494，E-mail：hhli1935@yahoo.cn

2010-02-01；

2010-05-05)