魏寶東, 林雨舒

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽(yáng) 110161)

納他霉素高產(chǎn)菌株發(fā)酵罐發(fā)酵條件研究

魏寶東, 林雨舒

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽(yáng) 110161)

考察溶氧量、補(bǔ)糖及p H值等因素對(duì)納他霉素高產(chǎn)菌株發(fā)酵罐生產(chǎn)納他霉素的影響。以搖瓶發(fā)酵結(jié)果為依據(jù),確定了發(fā)酵罐發(fā)酵的最適條件為:控制溶氧在30%～35%,補(bǔ)糖控制在發(fā)酵液糖質(zhì)量濃度約為2 g/dL,在納他霉素大量合成階段,維持發(fā)酵液中的p H值在5.2～5.4。該發(fā)酵條件下納他霉素產(chǎn)量從分批發(fā)酵的3.01 g/L提高到5.32 g/L。

納他霉素;發(fā)酵罐;發(fā)酵條件;產(chǎn)量

搖瓶發(fā)酵用于實(shí)驗(yàn)室較適宜,從搖瓶到發(fā)酵罐上的放大是發(fā)酵產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中的一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)都必須在發(fā)酵罐上進(jìn)行,且一般都采用攪拌式發(fā)酵罐。而產(chǎn)品也是通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室搖瓶中菌種選育和培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化,然后在小試、中式逐步得到驗(yàn)證、放大,獲得適合發(fā)酵罐發(fā)酵的工藝。因此有必要在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上,在7 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)研究。

1 材料與儀器

1.1 菌種

納他霉素生產(chǎn)菌株Streptomyce.natalensisSY-4795。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基(組分g/L) 葡萄糖40,大豆蛋白胨20,酵母粉4.5,p H 7.5。

1.2.2 斜面保藏培養(yǎng)基(組分g/L) 酵母浸粉2.0,可溶性淀粉10,瓊脂15,p H 7.3。

1.2.3 種子培養(yǎng)基(組分g/L) 葡萄糖20.0,大豆蛋白胨10.0,酪蛋白胨6.0,MgSO4·7H2O 1.0, NaCl 2.0,KH2PO40.5,p H 7.3。

1.3 試驗(yàn)儀器

BGZ-7智能型機(jī)械攪拌發(fā)酵罐:上海保興生物設(shè)備工程有限公司制造;KQ-C型全自控蒸汽滅菌鍋TH-3560:上海奉賢協(xié)新機(jī)電廠制造;ZWD-0.05/7全無(wú)油空氣壓縮機(jī):寧波鄞州展翅全無(wú)油空壓機(jī)有限公司制造。

2 試驗(yàn)方法

2.1 溶解氧濃度的確定

在搖瓶發(fā)酵過(guò)程中,控制溶解氧的量,滿足生產(chǎn)菌對(duì)氧的需要是提高發(fā)酵產(chǎn)量的重要因素之一。試驗(yàn)采用250 mL三角瓶,固定轉(zhuǎn)速,改變裝液量分別為25、30、35、40、45、50、55、60 mL來(lái)確定最佳溶解氧濃度。

2.2 7 L自動(dòng)罐分批發(fā)酵參數(shù)設(shè)定

根據(jù)搖瓶發(fā)酵的研究結(jié)果,在BGZ-7 L全自動(dòng)發(fā)酵罐中各過(guò)程參數(shù)控制設(shè)定值為:培養(yǎng)溫度29℃,罐壓0.01 MPa,裝液量5 L,接種體積分?jǐn)?shù)2%,消泡劑為聚醚,發(fā)酵時(shí)間120 h。

起始轉(zhuǎn)速為200 r/min,當(dāng)溶氧下降時(shí),增加轉(zhuǎn)速維持溶氧在30%～35%,最高轉(zhuǎn)速達(dá)到400 r/min,進(jìn)入抗生素分泌期,適當(dāng)降低攪拌轉(zhuǎn)速,維持溶解氧水平在30%～35%。

2.3 控制pH值的7 L自動(dòng)罐間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵

2.3.1 確定發(fā)酵液中葡萄糖的質(zhì)量濃度 流加時(shí)間以發(fā)酵液中還原糖水平為控制指標(biāo),發(fā)酵液初始葡萄糖質(zhì)量濃度均為4 g/dL,當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度分別降至3、2.5、2、1.5 g/dL時(shí)開(kāi)始,平均每隔6 h補(bǔ)糖一次,使葡萄糖質(zhì)量濃度各自維持在3、2.5、2、1.5 g/dL,確定能夠獲得最高產(chǎn)量的發(fā)酵液葡萄糖質(zhì)量濃度。

2.3.2 補(bǔ)糖種類及方式 補(bǔ)加碳源為50%的葡萄糖,根據(jù)2.3.1結(jié)果,選擇在葡萄糖降至2.0 g/dL以下時(shí)開(kāi)始補(bǔ)糖,并維持葡萄糖質(zhì)量濃度為在2.0 g/dL。

2.3.3 p H值控制 發(fā)酵液初始p H值為7.5。當(dāng)p H值降至5.2時(shí),控制7 L自動(dòng)罐開(kāi)始流加2 mol/L的NaOH來(lái)調(diào)節(jié)p H值,使抗生素分泌期的p H值維持在5.2～5.4之間,直到發(fā)酵結(jié)束。

3 結(jié)果與分析

3.1 溶解氧濃度對(duì)發(fā)酵的影響

由圖1可知,當(dāng)裝液量由25 mL增大到50 mL,納他霉素產(chǎn)量增加了52.90%,繼續(xù)增大裝液量,納他霉素產(chǎn)量開(kāi)始下降。在裝液量為60 mL時(shí),納他霉素產(chǎn)量達(dá)到最低值。裝液量對(duì)菌體生長(zhǎng)影響不大,在裝液量為25～30 mL時(shí),菌體干重在10 g/L左右波動(dòng);當(dāng)裝液量為35～60 mL時(shí),菌體干重在11.45 g/L左右波動(dòng),納他霉素產(chǎn)量隨裝液量的增加表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢(shì);當(dāng)裝液量為50 mL時(shí),溶解氧水平維持在30%～35%左右,達(dá)到最高值。

圖1 不同裝液量對(duì)菌體干重和納他霉素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of loading capacity on strain dry weight and yield of Natamycin

3.2 自動(dòng)罐分批發(fā)酵工藝參數(shù)的確定

3.2.1 攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流量對(duì)菌體干重和納他霉素產(chǎn)量的綜合影響 根據(jù)搖瓶發(fā)酵結(jié)果,從攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流量?jī)蓚€(gè)方面同時(shí)控制溶氧在30%～35%,使攪拌轉(zhuǎn)速不超過(guò)400 r/min,空氣流量隨時(shí)調(diào)整(不超過(guò)8 L/min),結(jié)果見(jiàn)圖2。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,空氣流量最高達(dá)6 L/min,可滿足要求。進(jìn)入穩(wěn)定期后,空氣流量和攪拌速度均下降,最終分別維持在3 L/min和300 r/min,結(jié)果納他霉素產(chǎn)量同搖瓶發(fā)酵相當(dāng)。

3.2.2 消泡劑的應(yīng)用效果 發(fā)酵過(guò)程中泡沫會(huì)帶來(lái)許多不利因素,為確定聚醚類消泡劑對(duì)菌體生長(zhǎng)和納他霉素合成有無(wú)影響,在搖瓶發(fā)酵條件下將未添加消泡劑和添加了聚醚消泡劑的搖瓶進(jìn)行比較,結(jié)果見(jiàn)圖3。應(yīng)用聚醚類消泡劑菌體干重達(dá)到11.01 g/L,比對(duì)照(11.26 g/L)減少了0.25 g/L;產(chǎn)量達(dá)到2.10 g/L,比對(duì)照減少0.03 g/L;消泡劑的添加對(duì)菌體生長(zhǎng)和納他霉素合成均無(wú)影響。7 L自動(dòng)罐可通過(guò)泡沫液位檢測(cè)電極自動(dòng)控制消泡劑的添加,維持發(fā)酵的正常進(jìn)行。

圖2 攪拌速度和空氣流量對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of stirring rotation speed and airflow on yield of Natamycin

圖3 搖瓶發(fā)酵聚醚類消泡劑對(duì)菌體干重和產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of polyether on strain dry weight and yield of Natamycin in shaking flask

3.2.3 7 L自動(dòng)罐分批發(fā)酵 在控制發(fā)酵過(guò)程的攪拌轉(zhuǎn)速、通氣流量等前提下,進(jìn)行7 L自動(dòng)罐分批發(fā)酵試驗(yàn),發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖、p H值、菌體干重和納他霉素產(chǎn)量等參數(shù)的變化見(jiàn)圖4。

如圖4所示,發(fā)酵過(guò)程中存在兩個(gè)典型的生理階段,即菌體生長(zhǎng)階段和代謝產(chǎn)物合成階段。在菌體生長(zhǎng)階段,發(fā)酵液中碳源質(zhì)量濃度迅速下降,p H值也下降較快,生物量迅速增加,并伴隨極少量納他霉素的產(chǎn)生。當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度消耗到1 g/dL以下時(shí),菌體生長(zhǎng)速度減慢,納他霉素開(kāi)始大量合成,即由菌體生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變?yōu)榇渭?jí)代謝產(chǎn)物合成階段,此階段產(chǎn)生的納他霉素約占總量的80%～90%。但隨著糖質(zhì)量濃度的不斷降低,菌體逐漸衰老甚至自溶,p H值上升。因碳源的供給不足,不能繼續(xù)合成納他霉素,在分批發(fā)酵中,納他霉素產(chǎn)量為3.01 g/L。

圖4 7 L自動(dòng)發(fā)酵罐分批發(fā)酵代謝曲線Fig.4 Metabolism curve of fermentation in batches in 7L automatic fermenter

3.3 控制pH值的7 L自動(dòng)罐間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 發(fā)酵液中葡萄糖適宜質(zhì)量濃度的確定 由表1可知,當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度降至3 g/dL和2.5 g/dL時(shí)補(bǔ)糖,由于時(shí)間過(guò)早,發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度過(guò)高,導(dǎo)致抗生素產(chǎn)量的增加;而維持1.5 g/ dL的糖質(zhì)量濃度又不能滿足納他霉素大量合成的需要,納他霉素的產(chǎn)率最低;當(dāng)還原糖質(zhì)量濃度降至2 g/dL時(shí),補(bǔ)糖并維持糖質(zhì)量濃度可延長(zhǎng)抗生素分泌期,使納他霉素以最大的生產(chǎn)速率不斷合成。

表1 發(fā)酵液中葡萄糖適宜質(zhì)量濃度的選擇結(jié)果T ab.1 Optimal glucose concentration in fermentation solution

3.3.2 補(bǔ)糖指標(biāo)控制 以發(fā)酵液中葡萄糖水平作為補(bǔ)糖指標(biāo),發(fā)酵液初始葡萄糖質(zhì)量濃度為4 g/dL,當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度降至2 g/dL時(shí)開(kāi)始補(bǔ)糖,平均每隔6 h補(bǔ)糖一次,葡糖糖的流加量控制在發(fā)酵液糖質(zhì)量濃度約為2 g/dL,菌體濃度基本不變,使產(chǎn)生菌的代謝趨于大量合成納他霉素。從84 h停止補(bǔ)糖后,葡萄糖消耗速度減緩,菌體量開(kāi)始下降,此時(shí)流加停止。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,葡萄糖總流加量為40 g/L。

3.3.3 補(bǔ)糖對(duì)p H值的影響 如圖5所示,在菌體生長(zhǎng)階段(24～60 h),由于葡萄糖代謝用于菌體增值,產(chǎn)生的有機(jī)酸使p H值下降較快,兩條曲線的趨勢(shì)基本相同。在抗生素分泌期(60～84 h),分批發(fā)酵p H值隨著葡萄糖的分解產(chǎn)酸不斷下降,最低時(shí)可降至4.7,直到發(fā)酵后期,隨著碳源的耗盡,菌體分解培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì),利用氨基酸作為能源和碳源,導(dǎo)致p H值上升。而間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵,由于碳源的間歇補(bǔ)入,菌體很快大量合成納他霉素,而不會(huì)由于分解葡萄糖產(chǎn)酸使p H值下降較多,此時(shí)發(fā)酵液中的p H值基本維持在5.2～5.4,說(shuō)明該p H值范圍適合納他霉素的生產(chǎn)。84 h補(bǔ)糖停止,p H值下降,但隨著碳源的耗盡,又呈現(xiàn)后期p H值上升的趨勢(shì)。

圖5 分批發(fā)酵和間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵中pH值的變化Fig.5 The comparison of pHchange between fermentation in batches and by interval adding glucose

3.3.4 攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流速控制 攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流速的控制與自動(dòng)罐分批發(fā)酵相似。發(fā)酵起始攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min,控制空氣流量2 L/min;菌體生長(zhǎng)階段,為滿足菌體生長(zhǎng)所需的氧濃度,轉(zhuǎn)速最高時(shí)達(dá)400 r/min,空氣流速8 L/min,維持溶解氧水平不低于30%,最終獲得較高的生物量。抗生素分泌期,由于碳源的間歇補(bǔ)入,對(duì)溶解氧水平有一定的影響。一般在補(bǔ)糖后產(chǎn)生菌的需氧量略有增加。此階段菌體濃度略有增加,納他霉素大量合成,維持溶解氧水平在30%～35%。

3.3.5 控制p H值的7 L自動(dòng)罐間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵 如圖6所示,菌體生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)S形。在發(fā)酵24～60 h,干重增長(zhǎng)最快,為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。60 h以后緩慢上升了一段時(shí)間后即停止生長(zhǎng),直至結(jié)束。納他霉素產(chǎn)量從開(kāi)始到36 h緩慢增長(zhǎng),從36～108 h呈直線上升,這是納他霉素主要產(chǎn)生和積累階段, 108 h后不再上升。由此,將補(bǔ)料分批發(fā)酵周期延長(zhǎng)至120 h,使發(fā)酵液中葡萄糖基本耗盡。納他霉素產(chǎn)量達(dá)到5.32 g/L,發(fā)酵罐的生產(chǎn)力從分批發(fā)酵的0.002 9 g/(L·h)提高到0.006 3 g/(L·h),設(shè)備利用率和納他霉素產(chǎn)量均有所提高。

4 結(jié) 語(yǔ)

以7 L自動(dòng)罐分批發(fā)酵各參數(shù)為依據(jù),確定了控制p H值的7 L自動(dòng)罐間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵的試驗(yàn)結(jié)果。從攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流量?jī)蓚€(gè)方面同時(shí)控制溶氧在30%～35%,并加入聚醚做消泡劑。葡萄糖的流加量控制在維持發(fā)酵液糖質(zhì)量濃度約為2 g/dL,發(fā)酵周期120 h。通過(guò)添加堿液控制發(fā)酵過(guò)程的p H在5.2～5.4,從而獲得更高的納他霉素產(chǎn)量。此發(fā)酵生產(chǎn)工藝中納他霉素產(chǎn)量達(dá)5.32 g/L,發(fā)酵罐的生產(chǎn)力從分批發(fā)酵的0.002 9 g/(L·h)提高到0.006 3 g/(L·h)。

圖6 間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵和控制pH間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵菌體干重及納他霉素產(chǎn)量的比較Fig.6 The comparison of strain dry weight and yield of Natamycin between fermentation in batches by interval adding glucose and pHcontrolled condition

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(責(zé)任編輯:李春麗)

Study of Natamycin High-Yield Strains Fermenter Fermentation Condition

WEI Bao-dong, LIN Yu-shu
(College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161,China)

The effect of the nutrition and environmental conditions,including dissolved oxygen, p H,added sugar and other factors on Natamycin production by Streptomyce natalensis SY-4795 were careful investigated,and the optimum conditions listed as follows:the dissolved oxygen 30%～35%,the constant sugar concentration in fermentation broth keep at 2%,p H 5.2～5.4. With the optimum fermentation conditions,natamycin production increase 3.01 g/L to 5.32 g/L in batch fermentation.

natamycin,fermenter,fermentation condition,yield

TQ 920.1

:A

1673-1689(2010)03-0448-05

2009-09-08

遼寧省教育廳科研項(xiàng)目(2008662)。

魏寶東(1969-),男,遼寧沈陽(yáng)人,副教授,農(nóng)學(xué)博士,碩導(dǎo),主要從事食品制造與保藏方面的研究。Email:bdwei2003@yahoo.com