王曉嵐, 王璇,, 張連富

(1.江南大學醫(yī)藥學院,江蘇無錫 214122;2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

番茄紅素納米分散體抗小鼠肝移植瘤的作用

王曉嵐1, 王璇1,2, 張連富2

(1.江南大學醫(yī)藥學院,江蘇無錫 214122;2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

為了研究番茄紅素納米分散體對腫瘤生長的影響及其機制,采用乳化-蒸發(fā)工藝(超聲乳化)制備了番茄紅素納米分散體并用小鼠移植型肝癌模型研究了番茄紅素納米分散體的體內(nèi)抗腫瘤作用和對機體抗氧化、抗增殖能力的影響。采用乳化-蒸發(fā)工藝(超聲乳化)可獲得納米級別的番茄紅素分散體系;番茄紅素納米分散體以1.95 mg/kg,3.9 mg/kg劑量給移植型肝癌H22小鼠用藥10 d后,移植瘤生長抑制率分別為32.37%,54.34%;同時可提高小鼠血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性,降低丙二醛(MDA)含量;可提高小鼠肝組織總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低過氧化氫(H2O2)、MDA含量;下調(diào)增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白表達。研究表明,番茄紅素納米分散體在體內(nèi)能明顯抑制移植瘤的生長,其機制可能與提高機體的抗氧化活性、抑制腫瘤細胞增殖有關(guān)。

番茄紅素;納米分散體;抗腫瘤作用;抗氧化活性;增殖細胞核抗原

番茄紅素(Lycopene)是一種重要的類胡蘿卜素,研究表明番茄紅素具有多種生理功能,如抗氧化、防癌抗癌、提高免疫能力、抗衰老、抗炎癥、抗凝血等[1-2],但由于番茄紅素是脂溶性色素,限制了其使用范圍。利用納米技術(shù)可有效改善難溶性組分的水溶性及貯藏穩(wěn)定性,并有可能提高其生物利用率,影響其生理功能[3]。關(guān)于納米級別番茄紅素的抗腫瘤作用研究尚未見報道。作者參照乳化-蒸發(fā)工藝[3-4](超聲乳化)制備了番茄紅素納米分散體,在此基礎(chǔ)上比較番茄紅素納米分散體和脂溶番茄紅素對移植型小鼠肝癌H22的作用,并比較其抗氧化能力和抗增殖能力,以探討番茄紅素納米分散體對腫瘤的作用及其可能機制,旨在為番茄紅素納米分散體的研究與開發(fā)利用積累有價值的資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑 質(zhì)量分數(shù)10%番茄紅素粉:華北制藥股份有限公司產(chǎn)品;乙酸乙酯、Tween-20:國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品;氟尿嘧啶注射液:南通精華制藥有限公司產(chǎn)品,批號:071201;大豆油:中糧食品銷售有限公司;總抗氧化能力(TAOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒:南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。小鼠增殖細胞核抗原(PCNA)免疫組化全套試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 實驗儀器 VCX500超聲破碎儀: SONICS&MATERIALS.INC產(chǎn)品;R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海申順生物科技有限公司產(chǎn)品;Nano ZS90型納米粒度及Zeta電位分析儀:Malvern Instruments,U K產(chǎn)品;2100型&UV-2100型分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司產(chǎn)品;電熱恒溫水浴鍋:上海精宏實驗設備有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗動物與細胞株 H22腹水瘤小鼠,購自上海醫(yī)藥工業(yè)研究院。

ICR小鼠,健康,雌性,體質(zhì)量18～22 g,購于揚州大學比較醫(yī)學中心,許可證號:SCXK(蘇) 2007-0001。

1.2 實驗方法

1.2.1 番茄紅素納米分散體樣品的制備 番茄紅素粉溶解于乙酸乙酯中,恒溫(50℃)緩慢滴加至含有定量Tween-20的水中。滴加完后以1 000 r/ min攪拌1 h,過濾,超聲破碎(冰浴,500 W,1.0～1.0秒/次,3 min)。最后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(50℃, 0.1MPa)以除去有機溶劑。所得樣品置于棕色玻璃瓶內(nèi)于4℃保存[3]。

1.2.2 空白乳化劑樣品的制備 含有定量Tween-20的水,以1 000 r/min攪拌1 h,過濾,超聲破碎(冰浴,500W,1.0～1.0脈沖,3min)。所得樣品置于棕色玻璃瓶內(nèi)于4℃保存。

1.2.3 脂溶番茄紅素樣品的制備 番茄紅素粉使用時以大豆油稀釋至所需濃度。

1.2.4 番茄紅素納米分散體粒徑的測定 采用激光光散射-Zeta電位分析儀對樣品的粒徑進行檢測,記錄Z-均粒徑和粒徑分布情況(多分散指數(shù)PDI)。

1.2.5 抗腫瘤實驗 無菌條件下,抽取接種傳代7 d的H22肝癌小鼠的腹水,用生理鹽水1:3稀釋混勻后,每只動物右前肢腋窩皮下注射0.2 mL。然后隨機分為5組:空白對照組、1.95 mg/kg分散體組、3.9 mg/kg分散體組、3.9mg/kg脂溶組、陽性對照組,每組10只。以灌胃量為0.2 mL/10g,空白對照組每鼠每天灌胃空白乳化劑樣品一次;1.95 mg/kg分散體組、3.9 mg/kg分散體組每鼠每天灌胃相應劑量的番茄紅素納米分散體樣品;脂溶組每鼠每天灌胃3.9 mg/kg脂溶番茄紅素一次,連續(xù)10 d。陽性對照組每鼠每天腹腔注射25 mg/kg氟尿嘧啶注射液一次,連續(xù)10 d。給藥期間,每日觀察小鼠的一般活動、皮毛和糞便等情況。第11 d處死動物,分離瘤塊稱質(zhì)量,計算抑瘤率:抑瘤率(%)=(空白組平均瘤重-給藥組平均瘤質(zhì)量)/空白組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.2.6 抗氧化實驗 動物分組、給藥同上。第11 d處死動物,取血清及制備肝勻漿測定相關(guān)指標。血清T-AOC、SOD、GSH-Px活性,MDA含量及肝勻漿T-AOC、SOD活性,MDA、H2O2含量測定:均按試劑盒說明書操作。

1.2.7 免疫組化實驗 留取適量瘤組織標本, 10%中性甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,石蠟切片脫蠟至水,按試劑盒說明書檢測瘤組織的增值細胞核抗原(PCNA)表達。顯微鏡下觀察,細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為PCNA陽性細胞,選取陽性率較高的5個視野,每個視野計數(shù)100個瘤細胞,PCNA陽性細胞取均值,作為陽性表達的百分率。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,顯著性檢驗采用SPSS16.0的單因素方差分析進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄紅素納米分散體樣品的粒徑大小和分布

肉眼觀察,番茄紅素納米分散體在水中分散均一,呈現(xiàn)明亮的紅色,沒有絮狀、顆粒狀的沉淀,樣品在4℃冷藏1個月后仍然澄清透明,無沉淀物,分散性較好;而脂溶的番茄紅素分布不均勻,且明顯可見大量顆粒沉淀在容器底部。所得結(jié)果如圖1所示,Z-均粒徑是根據(jù)信號檢測的相關(guān)曲線計算得到的,可以較直觀地反映體系中粒徑的變化,番茄紅素納米分散體樣品呈二峰分布,Z-均粒徑為261 nm,PDI(粒徑分布曲線的分布寬度指數(shù))為多分散性指數(shù),即粒徑分布曲線的分布寬度指數(shù),根據(jù)信號檢測的相關(guān)曲線計算得到,代表粒徑分布中的非均勻量,)較小,等于0.213,說明粒徑大小較均勻,其中峰1的粒徑為293.7 nm,強度為98.78%,寬度為107.4 nm,峰2的粒徑為5 251 nm,強度為1.217%,寬度為440.8 nm。表明采用乳化-蒸發(fā)工藝(超聲乳化)可以有效改善難溶性番茄紅素在水中的分散。

對于金屬與無機物,通常將粒徑在1～100 nm范圍的顆粒稱為納米粒;對于有機物和聚合物,習慣上將粒徑小于1 000 nm的顆粒稱為納米粒[5]。因此,所制備的番茄紅素樣品屬于納米分散體系。

圖1 番茄紅素納米分散體粒徑分布圖Fig.1 Particle distribution of lycopene narodispersion

2.2 對移植型小鼠肝癌H22的抑瘤作用

空白對照組小鼠接種瘤后活動度降低,毛色較接種前差,最早出現(xiàn)小鼠死亡。給予脂溶番茄紅素的小鼠亦活動度降低,毛色也較接種前差。給予番茄紅素納米分散體樣品的各組小鼠皮毛光滑,活動無異常。腹腔注射氟尿嘧啶注射液的小鼠出現(xiàn)松毛且腹瀉。抑瘤率實驗結(jié)果如表1所示,與空白對照組相比,3.9 mg/kg番茄紅素納米分散體對移植型小鼠肝癌H22具有明顯的抑制作用(P<0.05),抑瘤率達到53.34%。但1.95 mg/kg番茄紅素納米分散體對移植型小鼠肝癌抑瘤率僅為32.37%, 3.9 mg/kg脂溶番茄紅素對移植型小鼠肝癌H22的抑瘤率僅27.75%,兩組抑瘤作用與空白對照組差異均無顯著性意義。有學者報道20 mg/kg脂溶番茄紅素可有效抑制裸小鼠移植性肝癌肺轉(zhuǎn)移,與其抑制腫瘤的入侵、增殖及血管新生有關(guān),而1 mg/kg脂溶番茄紅素效果不明顯[6]。這提示3.9 mg/kg脂溶番茄紅素劑量較小,尚不能取得有效的抗腫瘤作用,而納米化后同樣劑量番茄紅素可以有效地抑制腫瘤生長,體現(xiàn)了納米分散體制劑的優(yōu)勢;1.95 mg/kg番茄紅素納米分散體尚不能有效抑制腫瘤生長,也屬劑量偏小,3.9 mg/kg可能是取得抑瘤效果的較低劑量。陽性對照藥抑瘤率高達70.52%,比其他受試樣品的抑瘤效果好,但從表中同樣可以看出荷瘤小鼠存活數(shù)最少,且小鼠毛發(fā)稀疏而精神萎靡,可能與化療藥物的毒副作用有關(guān)。

表1 對小鼠移植型肝癌H22的抑瘤作用Tab.1 The tumor growth inhibition on mice transplanted with hepatoma H22

2.3 對移植型肝癌H22小鼠血清酶活性、MDA含量的影響

如表2所示,與空白對照組小鼠相比,給番茄紅素納米分散體樣品的小鼠血清中GSH-Px活性都明顯升高,MDA含量都明顯下降,其中給3.9mg/kg劑量的小鼠改變更明顯(P<0.01);在相同劑量下,給予番茄紅素納米分散體樣品的小鼠血清T-AOC、SOD、GSH-Px活性都比給予脂溶番茄紅素的升高,MDA含量下降,但差異無顯著性意義。GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶,GSH-Px活力的高低可以間接反映機體清除氧自由基的能力;MDA的量反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,可以間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。上述實驗結(jié)果初步說明番茄紅素納米分散體具有明顯的抗氧化作用。

表2 移植型肝癌H22小鼠血清的抗氧化活性變化Tab.2 Changes of antioxidant activity of the serum of mice transplanted with hepatoma H22

2.4 對移植型肝癌H22小鼠肝組織酶活性、H2O2、MDA含量的影響

實驗結(jié)果如表3所示,與空白對照組小鼠相比,各組小鼠肝組織中H2O2、MDA含量均有所下降(P<0.05或P<0.01);并且給3.9 mg/kg番茄紅素納米分散體樣品的小鼠肝組織中T-AOC活性升高(P<0.05),SOD活性明顯升高(P<0.01)。與3.9 mg/kg脂溶組相比,在相同劑量下,給番茄紅素納米分散體樣品的小鼠肝組織中SOD活性明顯升高(P<0.05)。T-AOC反映機體總抗氧化能力,機體抗氧化能力的強弱與健康程度存在密切聯(lián)系;SOD是一種重要的抗氧化酶,能清除超氧陰離子自由基保護細胞;過氧化氫是活性氧,可以直接氧化一些酶的巰基,使酶失去活性,并可透過大部分細胞膜進入細胞內(nèi),形成脂質(zhì)過氧化物,導致細胞膜的損傷。由于機體產(chǎn)生的自由基不能被及時清除,化學性質(zhì)活潑的自由基與游離或結(jié)合狀態(tài)的不飽和脂肪酸作用,不但改變膜的結(jié)構(gòu)和功能,還誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)物增多[7]。MDA是過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物,如上所述它間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。通過實驗結(jié)果分析,可以說明番茄紅素納米分散體具有明顯的抗氧化作用,且相同劑量下,納米分散體比脂溶番茄紅素更有效增強SOD活性。

表3 移植型肝癌H22小鼠肝組織的抗氧化活性變化Tab.3 Changes of antioxidant activity of the liver of mice transplanted with hepatoma H22

2.5 對腫瘤組織PCNA表達的影響

陰性對照片腫瘤組織中僅見非特異性背景染色?？瞻讓φ战MPCNA呈強陽性表達,腫瘤細胞核呈深棕褐色。給予1.95、3.9 mg/kg納米分散體腫瘤組織PCNA表達色淺;給予3.9 mg/kg脂溶番茄紅素腫瘤組織PCNA表達多且色深;陽性對照組PCNA表達最少,色最淺。由表4可知,給予1.95、3.9 mg/kg番茄紅素納米分散體及給予3.9 mg/kg脂溶番茄紅素小鼠腫瘤組織的PCNA陽性表達細胞數(shù)較空白對照組均顯著下降,腹腔注射氟尿嘧啶的小鼠腫瘤組織PCNA陽性表達細胞數(shù)最低(均P<0.01)。給予不同劑量的番茄紅素納米分散體的小鼠都比給予脂溶番茄紅素的小鼠腫瘤組織PCNA陽性表達細胞百分率顯著性下降。PCNA是真核細胞DNA合成所必需的一種核蛋白,是DNA聚合酶δ的輔助蛋白,對DNA復制起著重要作用,其合成和表達與細胞增殖有關(guān),是細胞增殖的標志。本實驗結(jié)果提示番茄紅素納米分散體可能通過影響荷瘤小鼠腫瘤組織PCNA表達阻止細胞DNA復制而發(fā)揮抗腫瘤作用。

表4 腫瘤組織的增殖細胞核抗原陽性表達細胞百分率Tab.1 The percentage of PCNA positive cells in tumor tissue

3 結(jié) 語

納米技術(shù)是20世紀80年代末、90年代初迅速發(fā)展起來的一項高新科學技術(shù),已廣泛應用于材料、化工、醫(yī)藥、通信、能源等領(lǐng)域。近年來納米技術(shù)應用于食品和醫(yī)藥行業(yè),改善了活性成分和藥物的水溶性并增加了生物利用度,展示了技術(shù)創(chuàng)新的喜人前景[4]。

單線態(tài)氧和過氧化物與多種疾病(包括癌癥)有關(guān)。番茄紅素是天然胡蘿卜素中最有效的單線態(tài)氧捕捉劑[8]。早在20世紀50年代,美國醫(yī)學專家首次報道番茄紅素具有抗癌效應,但番茄紅素含多不飽和共軛雙鍵,性質(zhì)不穩(wěn)定,易被氧化破壞,不溶于水,這些均影響其生物利用率,因此隨后出現(xiàn)的各研究報道不盡一致。因此急需水溶性番茄紅素產(chǎn)品的問世。番茄紅素水溶性的提高,能使番茄紅素更好的應用于飲料、化妝品、復合維生素制品等,發(fā)揮其生物活性[9]。本實驗通過制備番茄紅素納米分散體,獲得粒徑納米級別、水中分散性好、穩(wěn)定的體系;在此基礎(chǔ)上進行體內(nèi)實驗,發(fā)現(xiàn)番茄紅素納米分散體比脂溶番茄紅素具有更有效的抗腫瘤作用,其機制可能與提高機體的抗氧化活性、抑制腫瘤細胞增殖有關(guān)。

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(責任編輯:楊萌)

Antitumor Effect of Lycopene Nanodispersion on Mice Transplanted with Hepatoma

WANG Xiao-lan1, WANG Xuan2, ZHANG Lian-fu2
(1.School of Medicine and Pharmaceutics,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.School of Food Science& Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

To investigate the effect and mechanism of lycopene nanodispersion on tumor growth, lycopene nanodispersion was prepared by the emulsification-evaporation process(the ultrasonic emulsification).The antitumor effect,antioxidant activity and anti-proliferation activity in vivo were studied with the model of mice transplanted with hepatoma H22.The results showed that lycopene nanodispersion was obtained by the process.When mice transplanted with hepatoma H22were treated with 1.95 mg/kg and 3.9 mg/kg lycopene nanodispersion for 10 days,the tumor growth inhibitory rate were 32.37%and 54.34%respectively.The intake of lycopene nanodispersion led to the increase of glutathione peroxidase(GSH-Px)activity,and the reduction of the mice serum malondialdehyde(MDA)content.It also led to the increase of total antioxidant capability(T-AOC)and superoxide dismutase(SOD)activity,but decrease the content of MDA and hydrogen peroxide(H2O2)of liver of mice.It also could inhibit the expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)in tumor tissue.These results suggestedthat lycopene nanodispersion can significantly suppress the growth of hepatoma H22in vivo.The increases of anti-oxidation activity and anti-proliferation activity may contribute to the antitumor mechanism.

lycopene,nanodispersion,antitumor activity,antioxidant activity,proliferating cell nuclear antigen

TS 202.3

:A

1673-1689(2010)03-0376-05

2009-04-16

國家“十一五”科技支撐計劃項目(2006BAD27B03);江蘇省自然科學基金項目(BK2009517)。

＊通信作者:王曉嵐(1962-),女,江蘇無錫人,醫(yī)學博士,副教授,主要從事天然藥食研究。Email:wangxl@ jiangnan.edu.cn