范麗霞，鄭繼平

（海南大學(xué) 食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228）

稀有放線菌的分離及抗菌篩選

范麗霞，鄭繼平

（海南大學(xué) 食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228）

通過對(duì)海南不同植被的土壤、對(duì)土樣不同的預(yù)處理方式及抑制劑的有無對(duì)稀有放線菌進(jìn)行分離、篩選出57株稀有放線菌，使用紙片擴(kuò)散法測定它們對(duì)大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉的拮抗作用.結(jié)果表明，從不同植被土壤分離的稀有放線菌數(shù)量上看，耕作土＞草甸土＞風(fēng)沙土；土樣不同的預(yù)處理后稀有放線菌的檢出中，自然風(fēng)干＞化學(xué)處理＞烘干處理；土壤共有8個(gè)菌株對(duì)指示菌有拮抗作用，其中3株具有進(jìn)一步研究的價(jià)值.

稀有放線菌；分離；拮抗作用

放線菌是一類重要的藥源微生物，大量常見菌株已被反復(fù)研究，從中發(fā)現(xiàn)新藥物的幾率逐漸降低，很多學(xué)者都逐漸轉(zhuǎn)向極端環(huán)境或有特色環(huán)境中篩選能產(chǎn)生新抗生素的放線菌［1］.如小單孢菌產(chǎn)生的慶大霉素、諾卡氏菌產(chǎn)生的利福霉素、馬杜拉放線菌產(chǎn)生的馬杜拉霉菌和洋紅霉素等［2-3］.目前，微生物抗生素的研發(fā)熱點(diǎn)已從鏈霉菌轉(zhuǎn)移到稀有放線菌［4-6］.海南島地處熱帶，在該地區(qū)對(duì)稀有放線菌進(jìn)行分離，并對(duì)其進(jìn)行抗菌篩選，對(duì)于放線菌藥物資源的開發(fā)利用具有重要的意義.

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

為海南的各地的山地風(fēng)沙土、林地草甸土、菜地耕作土各3個(gè)樣，共9個(gè)樣品.

1.2樣品預(yù)處理方法

土樣采集后，自然條件下風(fēng)干7 d，再用以下3種不同的物理、化學(xué)等方法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理.

A：自然風(fēng)干：即不進(jìn)行任何處理.

B：烘干處理：研磨過篩，120℃烘干處理1 h［7］.

C：化學(xué)處理：稱取1 g土樣，加入9 mL無菌水混勻，加入0.05％（w）的SDS和6％（w）的酵母膏，40℃振蕩20 min.

1.3 培養(yǎng)基

菌種分離選用高氏一號(hào)、改良高氏二號(hào)及腐殖酸培養(yǎng)基，菌種培養(yǎng)選用高氏一號(hào)培養(yǎng)基.

1）高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31.00 g，NaCl 0.50 g，K2HPO40.50 g，MgSO40.50 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂20.00 g，水1 000 mL，pH7.2～7.4.

2）改良高氏二號(hào)培養(yǎng)基［8］：葡萄糖1.0 g，蛋百胨0.5g，胰胨0.3g，NaCl 10.5g，瓊脂1.5g，pH7.2，瓊脂20.0 g；

3）腐殖酸培養(yǎng)基［9］：腐殖酸1.00 g，碳酸鈣0.02 g，磷酸氫二鈉0.50 g，硫酸鎂0.50 g，氯化鉀1.70 g，硫酸亞鐵0.01 g，核黃素0.50 mg，硫胺素0.50 mg，維生素B6 0.50 mg，煙酸0.50 mg，肌醇0.50 mg，泛酸0.50 mg，生物素0.25 mg，對(duì)－氨基苯甲酸0.50 mg，瓊脂18.00 g.

1.4 培養(yǎng)基中添加的抑制劑

100 mg/L放線菌酮和20 mg/L萘啶酮酸［8］.

1.5 稀有放線菌的鑒定［10－13］

按形態(tài)和培養(yǎng)特征進(jìn)行鑒定.依據(jù)《放線菌分類學(xué)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及《鏈霉素鑒定手冊(cè)》中的方法進(jìn)行稀有放線菌的鑒定和排除.

1.6 抗菌篩選試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法.以大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Stephylococcus aureus）、黑曲霉（Aspergillus niger）為指示菌進(jìn)行抗菌測定.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植被土壤分離到的稀有放線菌（見表1）

表1 海南土樣中放線菌和稀有放線菌總數(shù)Tab.1 The total quantity of actinoMycete and rare actinomycete in HaiNan soil

從表1可知，耕作土中無論是放線菌還是稀有放線菌，數(shù)量均最多，而風(fēng)沙土則兩種都最少，草甸土位于中間.這是因?yàn)楦魍镣寥婪柿λ礁?，含有適度水分，通氣條件好，而風(fēng)沙土相對(duì)干旱，有機(jī)質(zhì)含量低，環(huán)境惡劣，不利于微生物的生長繁殖［14］.而草甸土則各方面均位于二者之間.

從稀有放線菌占放線菌的比例來看，風(fēng)沙土為15％，草甸土為37％，耕作土為25％.可見草甸土中稀有放線菌所占比例最高，檢出率高，風(fēng)沙土稀有放線菌檢出率最低，這可能也是營養(yǎng)太缺乏所至.

2.2 土樣不同預(yù)處理及對(duì)稀有放線菌分離的影響

在土樣放置7d后［15］，對(duì)草甸土樣進(jìn)行3種不同預(yù)處理后，采用平板涂布法進(jìn)行微生物分離，統(tǒng)計(jì)放線菌和稀有放線菌菌株數(shù)，結(jié)果見表2.

表2 土樣不同預(yù)處理及抑制劑的有無對(duì)稀放線菌分離的影響Tab.2 The Isolation effect to rare actinoMycete With different pretreatment and having inhibitor or not

由表2可知，稀有放線菌的檢出中，自然風(fēng)干＞化學(xué)處理＞烘干處理.經(jīng)過化學(xué)處理和烘干處理后，稀有放線菌的檢出大大減少.分析原因，可能因?yàn)楹娓商幚頃?huì)殺死一些不耐熱的稀有放線菌，明顯降低稀有放線菌的分離效果，而化學(xué)處理在殺滅一些細(xì)菌和真菌的同時(shí)，也不可避免地殺滅了一些稀有放線菌.故如果沒有特殊的原因，一般不建議采取這兩種方法分離稀有放線菌.

2.3 抑制劑的運(yùn)用

表3 抑制劑對(duì)稀有放線菌分離的影響Tab.3 Effect of inhibitor on the isolation of rare actinoMycete

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，采用100 mg/L放線菌酮和20 mg/L萘啶酮酸能有效地抑制細(xì)菌和真菌，能達(dá)到分離較多稀有放線菌的目的.在平板上，細(xì)菌和真菌都很少，有效地解決了放線菌分離中細(xì)菌和真菌污染的問題.

2.4 抗菌活性篩選結(jié)果

在分離得到的57株稀有放線菌中，通過其發(fā)酵液的紙片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)篩選出8株具有抗菌活性的稀有放線菌，占稀有放線菌總數(shù)的14％.從表3中我們可以看出，同一種拮抗放線菌對(duì)不同靶標(biāo)菌活性有較大區(qū)別.總的來說，分離菌株中對(duì)枯草芽胞桿菌有抑制作用的較多，達(dá)到6株，其次為金黃色葡萄球菌和黑曲霉，各有3株，而對(duì)大腸桿菌有抑制作用的最少，僅有1株，表明海南土壤中稀有放線菌抗G＋細(xì)菌的能力強(qiáng)于抗G－細(xì)菌，抗真菌的能力也不錯(cuò).其中AGHD149對(duì)革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草桿菌）及革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）均有抑制作用，AGHDY88、AFHD15對(duì)革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草桿菌）有抑制作用，這3種菌有進(jìn)一步研究的價(jià)值.

表4 稀有放線菌發(fā)酵液的抑菌活性Tab.4 The antagonistic action of ferment liquid of rare actinoMycete

在這批有活性的8株稀有放線菌中，AGHDY176、AGHD149、AGHDY88、BGHD70、AGH DY132為耕作土中分離出來，其余3株為草甸土分離出來，而風(fēng)沙土則未分離出有活性菌株.

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)證實(shí)植被不同，其下土壤中的稀有放線菌的種類和數(shù)量也不同.耕作土中稀有放線菌數(shù)量最多，且在抗菌活性篩選中，耕作土中有活性的菌株也是最多，而風(fēng)沙土中稀有放線菌數(shù)量很少，且未發(fā)現(xiàn)有拮抗活性的菌株.說明耕作土土壤肥沃、透氣性好，也非常適合稀有放線菌的生長.

在海南得到的8株有活性的稀有放線菌中，AGHD149、AGHDY88、AFHD15這3株菌的抑菌活性較強(qiáng)，可能是具有較好開發(fā)潛力的拮抗菌株，有必要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究.

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責(zé)任編輯：黃 瀾

Isolation and Screening of Antagonistic Rare Actinomycetes

FAN Lixia，ZHENG Jiping
（Microbiology Laboratory，F(xiàn)ood College of Hainan University，Haikou 570228，China）

In the paper，we get 57 strains rare actinomycetes by isolation froMthe HaiNan soil of different vegetation、different pretreatment to the soil samples and having inhibitor or not.The slip of paper diffusion is used to measure the antagonistic action of the separated rare actinomycetes to Escherichia coli、Bacillus subtilis、Stephylococcus aureus and Aspergillus niger.The result indicated that the order of the quantity of rare actinomycetes of different vegetation is cropped soil＞meadoWsoil＞aeolian sandy soil；the order of the quantity of rare actinomycetes of different pretreatment to the soil samples is natural air drying＞chemical treatment＞furnace drying treatment.There are eight strains rare actinomycetes which have antagonistic action to the indicator，and three of theMis worthy of further study.

rare actinomycete；isolation；antagonistic action

Q 939.13

A

1674-4942（2010）02-0185-03

2010-03-25

海南省教育廳高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目（H jkj2008-06）