韓 燕 盧加河

復(fù)方清熱顆粒對大腸埃希菌外排泵影響的研究

韓 燕1盧加河2

目的觀察中藥復(fù)方清熱顆粒劑對耐環(huán)丙沙星大腸埃希氏菌外排泵耐藥機制的影響。方法建立急性耐環(huán)丙沙星大腸埃希菌腹腔感染兔模型，復(fù)方清熱顆粒藥液灌胃，空白對照組予等體積蒸餾水灌胃。末次給藥心臟取血，離心分離出含藥血清和空白血清。應(yīng)用外排泵抑制劑(CCCP)選擇出外排泵陽性的耐環(huán)丙沙星大腸埃希氏菌，應(yīng)用瓊脂對倍稀釋法檢測在有含藥血清、空白血清、復(fù)方清熱顆粒、泵抑制劑的情況下環(huán)丙沙星對上述7株大腸埃希氏菌的MIC值變化。結(jié)果中藥復(fù)方清熱顆粒含藥血清不能明顯降低環(huán)丙沙星對大腸埃希菌的MIC值。結(jié)論復(fù)方清熱顆粒含藥血清不能改善大腸埃希氏菌對環(huán)丙沙星的耐藥情況。

大腸埃希氏菌 外排泵 復(fù)方清熱顆粒 含藥血清

1河北省滄州市中心醫(yī)院(滄州061000)

2河北省滄州市人民醫(yī)院(滄州061000)

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，臨床上出現(xiàn)了大量耐藥菌株，大腸埃希菌是較常見的一種。大腸埃希菌的耐藥機制主要有產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶、藥物作用靶位的改變、外膜通透性的下降及主動外排活躍。細菌細胞膜上存在的各種藥物外排泵在大腸埃希菌的耐藥機制中起重要的作用，大腸桿菌是發(fā)現(xiàn)外排泵最多的一種細菌，在埃希大腸桿菌上發(fā)現(xiàn)了30多種外排泵，但一般認為AcrAB是最主要的外排泵。用基因敲除技術(shù)人工去除acrAB或tolC基因時，大腸埃希菌對上述藥物的敏感性明顯增加[1]。

1990年，革蘭陰性菌泵抑制劑研制成功[2]。外排泵抑制劑具有減少耐藥菌株的出現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)固有耐藥和獲得性耐藥菌株耐藥性的作用[3]，成為改善細菌耐藥的希望之一。體外試驗已經(jīng)證明，多種質(zhì)子泵抑制劑可以抑制銅綠假單胞菌、大腸埃希菌等外排泵，從而改善抗生素的抗菌活性，但因質(zhì)子泵抑制劑對人體的毒副作用過大而不能應(yīng)用于臨床。實驗經(jīng)證明，中藥復(fù)方清熱顆?？梢砸种沏~綠假單胞菌外排泵[4]。本研究繼續(xù)觀察中藥復(fù)方清熱顆粒對大腸埃希菌外排泵的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物和菌株 實驗動物為健康大耳白兔4只，體重范圍2.0～2.5kg，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心;實驗菌株為北京友誼醫(yī)院臨床分離菌株;質(zhì)控菌株為ATCC25922。

1.2 主要試劑及耗材 環(huán)丙沙星購自拜耳公司;西黃耆膠購自廣州南方化玻公司;復(fù)方清熱顆粒(含敗醬草、蒲公英、半枝蓮等)由北京未名天人公司提供;碳酰－氰－間氯苯腙(CCCP)，購自Sigma公司;丙酮購自北京化工廠;血瓊脂培養(yǎng)皿購自天津金章科技發(fā)展有限公司;M－H瓊脂購自BD公司。

1.3 實驗設(shè)備 電熱恒溫培養(yǎng)箱 DH6000AB型，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn);光電比濁儀，美國生物－梅里埃公司產(chǎn)。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 含藥血清的制備 兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，監(jiān)測呼吸頻率、心率、肛溫及體重，并觀察攝食情況。隨機分為兩組，模型組、空白對照組各2只，均禁食12h。模型組腹腔注射耐環(huán)丙沙星大腸埃希菌菌液，注射劑量2.5×109個/kg，4h后測肛溫、血常規(guī)。體溫 ＞39.5℃、白細胞總數(shù) ＞13×109/L者入選。模型組動物均符合上述標準而入選。造模成功后每日分2次灌胃復(fù)方清熱顆粒劑藥液，劑量為22g/kg·d，連續(xù)5d?？瞻讓φ战M予等體積蒸餾水灌胃，每日2次，連續(xù)5d。治療結(jié)束后禁食12h，無菌心臟采血，3000轉(zhuǎn)/s離心10min，制備含藥血清和空白血清后同組混和，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 外排泵陽性大腸埃希菌的選擇 選取臨床分離的耐環(huán)丙沙星大腸埃希菌18株，各挑取單菌落平板劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)皿中，36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，再挑取單菌落，用蒸餾水稀釋，比濁儀調(diào)節(jié)菌液至0.5麥氏濃度約108CFU/mL。同法配制ATCC 25922菌懸液作質(zhì)控。配制含環(huán)丙沙星的瓊脂平皿，質(zhì)量濃度(μg/mL)分別為 0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256。細菌接種量約為105CFU。即采用瓊脂對倍稀釋法測出環(huán)丙沙星(CIP)對上述18株大腸埃希菌的MIC值[藥物敏感試驗的操作及結(jié)果的解釋參照美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)2006版標準]。抗生素對倍稀釋瓊脂培養(yǎng)基中加入CCCP，濃度為5μg/mL(CCCP濃度依據(jù)國內(nèi)外文獻對喹諾酮類藥物與外排泵抑制劑相互作用的研究[5－6]，該濃度對外排泵有較好抑制作用，而對細菌生長無影響[7])。將18株大腸埃希菌菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液接種于含有CCCP和環(huán)丙沙星的瓊脂平皿上，接種量均為105CFU，36℃溫箱中培養(yǎng)24h，測出在有CCCP的情況下環(huán)丙沙星對上述18株大腸埃希菌的MIC值。比較兩組MIC值，如在有CCCP的情況下MIC值下降至原來的1/4或以下，即認為該菌株為外排泵陽性菌株[8](根據(jù)其原來MIC值大小分別命名為 E1 ～E7，見表 1)。

表1 應(yīng)用CCCP前后CIP對外排泵陽性菌株MIC值的變化 (μg/mL)

2.3 外排泵陽性菌株的藥敏結(jié)果 (1)含藥血清和空白血清MIC值測定:配制20mL含藥血清瓊脂平皿，含藥血清含量分別為0.5mL、1mL、2mL、4mL。接種上述7株大腸埃希菌菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液于含藥血清瓊脂平皿中，細菌接種量約為105CFU，于36℃衡溫箱培育24小時。各平皿7株大腸埃希菌均生長良好。未測出含藥血清的MIC值。同樣方法亦未測出空白血清的MIC值。(2)CCCP的MIC值測定:配制含CCCP瓊脂平皿，CCCP 濃度(μg/mL)分別為 0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320。接種菌懸液于其中，接種量同上，于36℃衡溫箱培育24h。各瓊脂平皿上7株大腸埃希菌生長良好，未測出CCCP的MIC值。(3)空白血清+CIP組、含藥血清+CIP組MIC值的測定:制備含空白血清和CIP的瓊脂平皿，每個平皿中均加入空白血清 2mL，CIP 濃度分別為(μg/mL)2、4、8、16、32、64、128。接種菌懸液于瓊脂平皿，并于36℃衡溫箱培育24h。制備含含藥血清和CIP的瓊脂平皿，分為3組，每組CIP的濃度(μg/mL)均為2、4、8、16、32、64、128。3 組平皿中含藥血清分別為 0.5mL、1mL、2mL。接種菌懸液于瓊脂平皿，并于36℃衡溫箱培育24h(CIP組、空白血清+CIP組、含藥血清+CIP組MIC值比較見表2)。

3 討論

大腸埃希菌細胞膜上的藥物主動外排系統(tǒng)是導(dǎo)致大腸埃希菌對多種抗菌藥物固有或獲得性多重耐藥的重要原因[9－10]，外排泵抑制劑在臨床治療中有較好的應(yīng)用前景。

本實驗觀察到，CIP+空白血清組MIC值較西藥組MIC值有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明空白血清不能明顯改善銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星的耐藥情況;CIP+含藥血清組MIC值較西藥組MIC值的差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明含藥血清也不能明顯改善大腸埃希菌對環(huán)丙沙星的耐藥情況。

此前實驗已經(jīng)證明中藥復(fù)方清熱顆?？梢砸种沏~綠假單胞菌的外排泵[4]，而本實驗表明復(fù)方清熱顆粒不能對大腸埃希菌外排泵有明顯的抑制作用。通過這種相反的結(jié)果可以推斷這兩種外排泵外排環(huán)丙沙星的機制可能不同。本實驗雖沒有取得陽性結(jié)果，但也為外排泵抑制劑的研究提供了一些參考。

表2 應(yīng)用空白血清、含藥血清前后CIP對大腸埃希菌MIC值的變化 (μg/mL)

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The Experiment of Compound Clearing-Heat Granules on Efflux Pumps of Escherichia Coli

HAN Yan1， LU Jia－h(huán)e2
1Cangzhou Central Hospital，Hebei Province(Cangzhou 061001)
2Cangzhou People's Hospital，Hebei Province(Cangzhou 061000)

Objective:To obseve the effect of compound clearing－h(huán)eat granules on the mechanism of CIP－resistance Escherichia coli efflux pump.MethodsRabbit models were created by the acute CIP－resistant Escherichia coli abonomal infection.Those in the model group were given compound clearing－h(huán)eat granules through stomache，while the normal group were given water in the same way and the same dose.After the last giving drug， the drug serum and blank serum were separated from heart blood.7 mutants of positive efflux pump CIP－resisitance Escherichia coli were selected by CCCP.The MIC of CIP adding drug serum，blank serum， compound clearing－h(huán)eat granules and CCCP to those bacterials were measured by the agar dilution method.ResultsCompound Clearing－h(huán)eat Granules serum can not decrease the MIC of CIP to Escherichia coli.Conclusions:The resistance of the efflux pumps with the peudomonas aeruginosa could not be increased by the compound clearing－h(huán)eat granules.

Escherichia coli;efflux pump;Compound Clearing－h(huán)eat Granules;Drug serum

R285.5

A

1004－745X(2010)09－1562－02

2010－01－17)