李永領(lǐng) 項(xiàng)洪武 朱烈烈 陳大慶

人參皂苷對(duì)重度顱腦外傷大鼠模型環(huán)氧合酶－2表達(dá)的影響＊

李永領(lǐng) 項(xiàng)洪武 朱烈烈 陳大慶

目的 觀察人參皂苷對(duì)重度顱腦外傷大鼠模型環(huán)氧合酶(cyclooxgenase－2，COX－2)mRNA表達(dá)的影響。方法選取健康wistar大鼠56只，分為正常對(duì)照組、模型組和人參皂苷組，F(xiàn)eeney法制作重度顱腦外傷模型，人參皂苷組在造模前30min按5mg/kg灌胃人參皂苷。造模后6、24、72h共3個(gè)時(shí)相點(diǎn)取各組大鼠腦組織，應(yīng)用RT－PCR法檢測(cè)各組神經(jīng)細(xì)胞COX－2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果正常對(duì)照組未見COX－2 mRNA的表達(dá);模型組和人參皂苷組腦外傷后6h出現(xiàn)COX－2 mRNA的表達(dá)，24h達(dá)到高峰，72h后明顯減少;人參皂苷組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)COX－2 mRNA的表達(dá)明顯低于模型組。結(jié)論重度腦外傷存在COX－2 mRNA的異常表達(dá)，人參皂苷能抑制COX－2 mRNA的表達(dá)，可能對(duì)腦外傷有一定的保護(hù)作用。

人參皂苷 重度顱腦外傷 環(huán)氧合酶－2

溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院(溫州325027)

＊溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院院級(jí)課題(No.2007yy13)

重度顱腦外傷有著較高的致殘率和死亡率，隨著研究的深入，對(duì)顱腦外傷后繼發(fā)性腦損傷在創(chuàng)傷后病理生理過程中的認(rèn)識(shí)也逐步加深，其中炎癥是繼發(fā)性腦損傷的一個(gè)重要組成環(huán)節(jié)。環(huán)氧合酶－2(cyclooxgenase－2，COX－2)是花生四烯酸代謝的限速酶，后者產(chǎn)生的前列腺素及血栓素是腦創(chuàng)傷后炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要介質(zhì)。本研究觀察大鼠重度顱腦外傷后COX－2 mRNA的表達(dá)變化及人參皂苷對(duì)其的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物:健康雄性wistar大鼠56只(溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體質(zhì)量170～250g。試藥:人參皂苷購自上海市藥品檢驗(yàn)所，純度94.7%;Trizol液購自加拿大BBI公司;MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自日本TOYOBA公司;引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR Master Mix試劑盒購自美國Promega公司。儀器:高速低溫離心機(jī)(Allegra64R Centrifuge，美國Beckman公司);低溫冰箱 (R－404A，美國Forma Scientific公司);PCR儀(GeneAmp9600，美國Perkin Elmer公司);紫外透射反射儀(FS－312，上海復(fù)生生物工程研究所);凝膠成像系統(tǒng)(Gene，USA)及Scanband圖像分析軟件系統(tǒng)。

1.2 分組及建模 56只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組8只，模型組24只，人參皂苷組24只(術(shù)前30min按5.0mg/kg灌胃人參皂苷溶液)。模型組及人參皂苷組以5%氯胺酮80～100mg/kg腹腔內(nèi)注射，將麻醉后的大鼠俯臥固定于自制的簡易落體致傷裝置。參照Feeney法[1]將頂部皮膚矢狀切開，在“人”字縫前3mm、中線右3mm頂部顱骨鉆孔并擴(kuò)大骨窗(直徑5mm)，不越過中線，暴露硬膜，將底面直徑3mm的致傷撞墊輕輕置于骨窗中央的硬膜上，用20g重物自40cm高處沿滑桿垂直落下打擊撞墊(沖擊力為800g·cm)，造成大鼠右頂葉局限性腦挫裂傷，間斷縫合頭皮，整個(gè)過程均無菌操作。于術(shù)后6、24、72h分別將大鼠處死，無菌下開顱取部分外傷腦組織，－70℃保存?zhèn)錅y(cè)。

1.3 RT－PCR法 用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄體系為 20μL: 細(xì)胞總 RNA3μL(2.5～3μg)，10U/μL RNAsin 1μL，5 ×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液 4μL，10μmol/L dNTP 2μL，25pmol/μmL隨機(jī)引物1μL，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶100U，25mmol/L MgCl2 0.5μL。30℃反應(yīng) 10min，42℃反應(yīng) 20min，99℃反應(yīng) 5min，終止反應(yīng)。引物根據(jù)軟件Oligo6.0設(shè)計(jì)。COX－2上游引物:5'－ACG GAC TTG CTC ACT TTG－3'，下游引物:3'－CAT TAG GGT AGA CAA GAG－5';擴(kuò)增片段長度376bp。內(nèi)參照β－肌動(dòng)蛋白上游引物:5'－ACG TTG ACA TCC GTA AAG －3'，下游引物:3'－CGG AGT GAC AGG TGG AAG－5';擴(kuò)增片段長度200bp。PCR擴(kuò)增體系為 25μL:逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2μL(0.1 ～2μg)，10pmol/μL 上、下游引物各 2.5μL，PCR Master Mix12.5μL，其余以無核酶水補(bǔ)足至25μL。擴(kuò)增條件:94℃反應(yīng)10min，94℃反應(yīng)45s，58℃反應(yīng)1min，72℃反應(yīng)1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(80V，35min)后，紫外透射儀下觀察并照相，在凝膠上進(jìn)行掃描定量，以目的基因與內(nèi)參照的熒光比值代表mRNA的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

見圖1、表1。模型組和人參皂苷組各個(gè)時(shí)相點(diǎn)均可見COX－2 mRNA的表達(dá)。正常對(duì)照組未見COX－2 mRNA的表達(dá)，模型組腦外傷后6h出現(xiàn)COX－2 mRNA的表達(dá)，24h達(dá)到高峰，72h后明顯減少，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);人參皂苷組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)COX－2 mRNA的表達(dá)均低于模型組(P ＜ 0.05)。

3 討論

人參總皂苷含人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1等主要活性成分，具有改善微循環(huán)、抗自由基、阻止鈣離子內(nèi)流和抑制炎癥反應(yīng)多重作用[2]。

表1 各組COX－2 mRNA表達(dá)比較 (±s)

表1 各組COX－2 mRNA表達(dá)比較 (±s)

與正常對(duì)照組比較，＊P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05

傷后24h 傷后72h組 別正常對(duì)照組模型組人參皂苷組n 8 2 4 24傷后6h 0.0000 ± 0.0000 0.0602 ± 0.1301＊0.0421 ±0.1001＊△0.1462 ±0.1002＊△0.0903 ±0.0921＊△0.1027 ± 0.0832＊0.0804 ± 0.0975＊△

圖1 COX－2 mRNA在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)

在生理狀態(tài)下，COX－2在大多數(shù)組織中以極低拷貝數(shù)表達(dá)。但脂多糖、白細(xì)胞介素－1、腫瘤壞死因子、血清、表皮生長因子α和血小板活化因子等許多炎癥刺激因子均可誘導(dǎo)COX－2的基因表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)和多種疾病的病理過程，且蛋白合成抑制劑不能抑制COX－2 mRNA的表達(dá)，因此COX－2是一種即時(shí)基因。COX－2主要存在于神經(jīng)細(xì)胞。腦損傷時(shí)，COX－2及其代謝產(chǎn)物至少可在脈管系統(tǒng)、血腦屏障和神經(jīng)元本身3個(gè)環(huán)節(jié)加重腦損傷。本研究結(jié)果顯示正常腦組織中未見COX－2 mRNA的表達(dá)，腦外傷后6h出現(xiàn)COX－2 mRNA的表達(dá)，24h達(dá)到高峰，72h后COX－2的表達(dá)明顯減少。Strauss等[3]應(yīng)用免疫斑點(diǎn)技術(shù)對(duì)大鼠腦損傷后COX－2蛋白表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷后損傷區(qū)腦皮質(zhì)COX－2表達(dá)在1d時(shí)顯著增加，3d達(dá)高峰。而海馬區(qū)COX－2表達(dá)腦損傷后2h開始增加，1d達(dá)高峰，3d下降至正常水平。Strauss等[3]應(yīng)用原位雜交技術(shù)對(duì)腦損傷COX－2 mRNA含量進(jìn)行研究時(shí)還發(fā)現(xiàn)，外傷后2～6h COX－2 mRNA含量在皮質(zhì)及海馬均開始增加，24h達(dá)高峰，72h時(shí)仍高于正常水平。Kunz等[4]對(duì)外傷后COX－2 mRNA含量的研究結(jié)果與Schwab等[5]相似。這種變化趨勢(shì)與本研究結(jié)果一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，人參皂苷組各個(gè)時(shí)相點(diǎn)COX－2 mRNA的表達(dá)均低于模型組，說明人參皂苷能明顯抑制這種異常表達(dá)。因COX－2是催化花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，而前列腺素是非常重要的炎性因子，故通過抑制COX－2活性可有效地降低炎性反應(yīng)。因此，在腦外傷早期應(yīng)用人參皂苷，對(duì)重型腦外傷可能具有保護(hù)作用。

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