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        人參皂苷對重度顱腦外傷大鼠模型環(huán)氧合酶-2表達的影響*

        2010-08-27 05:58:22李永領(lǐng)項洪武朱烈烈陳大慶
        中國中醫(yī)急癥 2010年9期
        關(guān)鍵詞:腦外傷腦損傷皂苷

        李永領(lǐng) 項洪武 朱烈烈 陳大慶

        人參皂苷對重度顱腦外傷大鼠模型環(huán)氧合酶-2表達的影響*

        李永領(lǐng) 項洪武 朱烈烈 陳大慶

        目的 觀察人參皂苷對重度顱腦外傷大鼠模型環(huán)氧合酶(cyclooxgenase-2,COX-2)mRNA表達的影響。方法選取健康wistar大鼠56只,分為正常對照組、模型組和人參皂苷組,F(xiàn)eeney法制作重度顱腦外傷模型,人參皂苷組在造模前30min按5mg/kg灌胃人參皂苷。造模后6、24、72h共3個時相點取各組大鼠腦組織,應(yīng)用RT-PCR法檢測各組神經(jīng)細胞COX-2 mRNA的表達。結(jié)果正常對照組未見COX-2 mRNA的表達;模型組和人參皂苷組腦外傷后6h出現(xiàn)COX-2 mRNA的表達,24h達到高峰,72h后明顯減少;人參皂苷組各個時間點COX-2 mRNA的表達明顯低于模型組。結(jié)論重度腦外傷存在COX-2 mRNA的異常表達,人參皂苷能抑制COX-2 mRNA的表達,可能對腦外傷有一定的保護作用。

        人參皂苷 重度顱腦外傷 環(huán)氧合酶-2

        溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院(溫州325027)

        *溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院院級課題(No.2007yy13)

        重度顱腦外傷有著較高的致殘率和死亡率,隨著研究的深入,對顱腦外傷后繼發(fā)性腦損傷在創(chuàng)傷后病理生理過程中的認識也逐步加深,其中炎癥是繼發(fā)性腦損傷的一個重要組成環(huán)節(jié)。環(huán)氧合酶-2(cyclooxgenase-2,COX-2)是花生四烯酸代謝的限速酶,后者產(chǎn)生的前列腺素及血栓素是腦創(chuàng)傷后炎癥級聯(lián)反應(yīng)的重要介質(zhì)。本研究觀察大鼠重度顱腦外傷后COX-2 mRNA的表達變化及人參皂苷對其的影響。

        1 材料與方法

        1.1 材料 動物:健康雄性wistar大鼠56只(溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心),體質(zhì)量170~250g。試藥:人參皂苷購自上海市藥品檢驗所,純度94.7%;Trizol液購自加拿大BBI公司;MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自日本TOYOBA公司;引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR Master Mix試劑盒購自美國Promega公司。儀器:高速低溫離心機(Allegra64R Centrifuge,美國Beckman公司);低溫冰箱 (R-404A,美國Forma Scientific公司);PCR儀(GeneAmp9600,美國Perkin Elmer公司);紫外透射反射儀(FS-312,上海復(fù)生生物工程研究所);凝膠成像系統(tǒng)(Gene,USA)及Scanband圖像分析軟件系統(tǒng)。

        1.2 分組及建模 56只大鼠隨機分為正常對照組8只,模型組24只,人參皂苷組24只(術(shù)前30min按5.0mg/kg灌胃人參皂苷溶液)。模型組及人參皂苷組以5%氯胺酮80~100mg/kg腹腔內(nèi)注射,將麻醉后的大鼠俯臥固定于自制的簡易落體致傷裝置。參照Feeney法[1]將頂部皮膚矢狀切開,在“人”字縫前3mm、中線右3mm頂部顱骨鉆孔并擴大骨窗(直徑5mm),不越過中線,暴露硬膜,將底面直徑3mm的致傷撞墊輕輕置于骨窗中央的硬膜上,用20g重物自40cm高處沿滑桿垂直落下打擊撞墊(沖擊力為800g·cm),造成大鼠右頂葉局限性腦挫裂傷,間斷縫合頭皮,整個過程均無菌操作。于術(shù)后6、24、72h分別將大鼠處死,無菌下開顱取部分外傷腦組織,-70℃保存?zhèn)錅y。

        1.3 RT-PCR法 用Trizol一步法提取細胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄體系為 20μL: 細胞總 RNA3μL(2.5~3μg),10U/μL RNAsin 1μL,5 ×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液 4μL,10μmol/L dNTP 2μL,25pmol/μmL隨機引物1μL,MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶100U,25mmol/L MgCl2 0.5μL。30℃反應(yīng) 10min,42℃反應(yīng) 20min,99℃反應(yīng) 5min,終止反應(yīng)。引物根據(jù)軟件Oligo6.0設(shè)計。COX-2上游引物:5'-ACG GAC TTG CTC ACT TTG-3',下游引物:3'-CAT TAG GGT AGA CAA GAG-5';擴增片段長度376bp。內(nèi)參照β-肌動蛋白上游引物:5'-ACG TTG ACA TCC GTA AAG -3',下游引物:3'-CGG AGT GAC AGG TGG AAG-5';擴增片段長度200bp。PCR擴增體系為 25μL:逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2μL(0.1 ~2μg),10pmol/μL 上、下游引物各 2.5μL,PCR Master Mix12.5μL,其余以無核酶水補足至25μL。擴增條件:94℃反應(yīng)10min,94℃反應(yīng)45s,58℃反應(yīng)1min,72℃反應(yīng)1min,共35個循環(huán),最后72℃延伸5min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(80V,35min)后,紫外透射儀下觀察并照相,在凝膠上進行掃描定量,以目的基因與內(nèi)參照的熒光比值代表mRNA的表達水平。

        2 結(jié)果

        見圖1、表1。模型組和人參皂苷組各個時相點均可見COX-2 mRNA的表達。正常對照組未見COX-2 mRNA的表達,模型組腦外傷后6h出現(xiàn)COX-2 mRNA的表達,24h達到高峰,72h后明顯減少,與正常對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);人參皂苷組各個時間點COX-2 mRNA的表達均低于模型組(P < 0.05)。

        3 討論

        人參總皂苷含人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1等主要活性成分,具有改善微循環(huán)、抗自由基、阻止鈣離子內(nèi)流和抑制炎癥反應(yīng)多重作用[2]。

        表1 各組COX-2 mRNA表達比較 (±s)

        表1 各組COX-2 mRNA表達比較 (±s)

        與正常對照組比較,*P <0.05;與模型組比較,△P <0.05

        傷后24h 傷后72h組 別正常對照組模型組人參皂苷組n 8 2 4 24傷后6h 0.0000 ± 0.0000 0.0602 ± 0.1301*0.0421 ±0.1001*△0.1462 ±0.1002*△0.0903 ±0.0921*△0.1027 ± 0.0832*0.0804 ± 0.0975*△

        圖1 COX-2 mRNA在實驗組中的表達

        在生理狀態(tài)下,COX-2在大多數(shù)組織中以極低拷貝數(shù)表達。但脂多糖、白細胞介素-1、腫瘤壞死因子、血清、表皮生長因子α和血小板活化因子等許多炎癥刺激因子均可誘導(dǎo)COX-2的基因表達,參與炎癥反應(yīng)和多種疾病的病理過程,且蛋白合成抑制劑不能抑制COX-2 mRNA的表達,因此COX-2是一種即時基因。COX-2主要存在于神經(jīng)細胞。腦損傷時,COX-2及其代謝產(chǎn)物至少可在脈管系統(tǒng)、血腦屏障和神經(jīng)元本身3個環(huán)節(jié)加重腦損傷。本研究結(jié)果顯示正常腦組織中未見COX-2 mRNA的表達,腦外傷后6h出現(xiàn)COX-2 mRNA的表達,24h達到高峰,72h后COX-2的表達明顯減少。Strauss等[3]應(yīng)用免疫斑點技術(shù)對大鼠腦損傷后COX-2蛋白表達研究發(fā)現(xiàn),腦損傷后損傷區(qū)腦皮質(zhì)COX-2表達在1d時顯著增加,3d達高峰。而海馬區(qū)COX-2表達腦損傷后2h開始增加,1d達高峰,3d下降至正常水平。Strauss等[3]應(yīng)用原位雜交技術(shù)對腦損傷COX-2 mRNA含量進行研究時還發(fā)現(xiàn),外傷后2~6h COX-2 mRNA含量在皮質(zhì)及海馬均開始增加,24h達高峰,72h時仍高于正常水平。Kunz等[4]對外傷后COX-2 mRNA含量的研究結(jié)果與Schwab等[5]相似。這種變化趨勢與本研究結(jié)果一致。

        本研究還發(fā)現(xiàn),人參皂苷組各個時相點COX-2 mRNA的表達均低于模型組,說明人參皂苷能明顯抑制這種異常表達。因COX-2是催化花生四烯酸合成前列腺素的限速酶,而前列腺素是非常重要的炎性因子,故通過抑制COX-2活性可有效地降低炎性反應(yīng)。因此,在腦外傷早期應(yīng)用人參皂苷,對重型腦外傷可能具有保護作用。

        [1]Feeney.D M,Boyeson M G,Linn R T,et al.Responses to cortical injury:I.Methodology and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res,1981,211(1):67 -77.

        [2]吳曉燕.人參總皂苷對大鼠缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡的保護及作用機制的研究 [J].神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生,2005,5(5):347-350.

        [3]Strauss K I,Barbe M F, Marshall R M, et al.Prolonged cyclooxygenase-2 induction in neurons and glia following traumatic brain injury in the rat[J].J Neurotrauma, 2000, 17(8):695 -711.

        [4]Kunz T, Marklund N, Hillered L, et al. Cyclooxygenase-2,prostaglandin synthases,and prostaglandin H2 metabolism in traumatic brain injury in the rat [J].J Neurotrauma, 2002, 19(9):1051-1064.

        [5]Schwab J M, Beschorner R,Meyermann R,et al.Persistent accumulation of cyclooxygenase- 1-expressing microglial cells and macrophages and transient upregulation by endothelium in human brain injury[J].J Neurosurg, 2002, 96(5):892 - 899.

        R285.5

        A

        1004-745X(2010)09-1556-02

        2010-03-14)

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