付春麗, 邢英琦, 宋曉南

動脈粥樣硬化常常是引起血管狹窄和閉塞的主要原因,其發(fā)生與炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(The matrix metalloproteinases,MMPs)的相互作用密切相關。MMPs是分解細胞外基質(zhì)的蛋白酶類中最主要的一類,它參與血管再生,炎癥反應等病理過程,是可以降解細胞外基質(zhì)分子的鋅依賴性酶,主要降解基底膜的細胞外基質(zhì)成分。其中 MMP-3能夠激活其他酶原形成一正反饋環(huán),在 MMP家族激活過程中具有關鍵作用。目前生理學證明基因的改變可以精確的調(diào)控 MMPs酶原及其抑制劑的活性。MMPs活性調(diào)控的破壞已經(jīng)成為動脈粥樣硬化、炎癥、血管再生和腫瘤形成共有的病理過程。目前國外研究顯示 MMP-3啟動子的基因多態(tài)性與頸動脈狹窄有關[1]。而國內(nèi)尚未有關 MMP-3基因多態(tài)性與顱內(nèi)大動脈狹窄的關聯(lián)性研究。本研究收集北方漢族人群大腦中動脈狹窄病例與相應對照組,擬探討 MMP-3基因啟動子區(qū)多態(tài)性與大腦中動脈狹窄風險的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

119例大腦中動脈狹窄(病例組)為 2006年 1月 ～2009年 6月于吉林大學第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科經(jīng)顱多普勒超聲(TCD)證實為大腦中動脈狹窄的中國北方漢族患者,92例作為對照的北方漢族人群(對照組)經(jīng)顱內(nèi)彩色多普勒超聲 TCD檢測無異常。所有研究對象均知情同意。詳細詢問病史,重點是腦血管病危險因素病史。記錄所有研究對象年齡,性別,癥狀,TCD結(jié)果。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

以 EDTA抗凝,抽取兩組人群外周靜脈血 2～3 ml,-20℃保存。采用全血 DNA提取試劑盒(Takara,大連寶生物)提取白細胞 DNA,-70℃保存。

1.2.2 MMP3基因分型采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應 (PCR-RFLP)方法

(1)PCR擴增 MMP-3啟動子 -1171(5A/6A)位點及其側(cè)翼區(qū):正向引物序列為:5'-GGTTCTCCATTCCTTTGATGGGGGGAAAgA-3';反向引物序列為:5'-CTTCCTGGAATTCACATCACTGCCACCACT-3'。將正向引物 3'末端的第二個核苷酸 A換為 G以便于在 5A等位基因上產(chǎn)生 Tth111I(GACNNNGTC)的識別位點。PCR反應體系是:10×PCR buffer 5μl,dNTP 4μl,正反向引物各 1μl,Ex Taq酶(TaKa-Ra,大連寶生物 )0.25μl,模板 3 ～5μl,滅菌雙蒸水定容至 50μl。 PCR反應條件:94℃ 5min(預變性);94℃(變性)30s,65℃(退火)30s,72℃(延伸 )30s,共30個循環(huán);72℃10min。其中每次 PCR反應均設有陰性對照,即用無菌雙蒸水替代模板,確保 PCR反應無污染。

(2)電泳:將適量 PCR產(chǎn)物加相應量的 6×Loading Buffer混勻后,在 3%瓊脂糖凝膠中電泳,電泳條件為:輸出電壓 100V,20min,紫外燈下觀察電泳結(jié)果(見圖1)。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

(3)酶切:酶切體系為:Tth111 I 1μl;10×酶切buffer 2μl;PCR產(chǎn)物 4μl;滅菌雙蒸水定容至 20μl。65℃下反應 3h,3%瓊脂糖凝膠電泳,6A/6A基因型無酶切位點,故酶切后仍為 129bp一條帶;5A/6A基因型中 5A可被切開,故酶切后為 129bp,97bp,32bp 3條帶,其中 32bp太小在電泳圖中看不到;5A/5A則可被切為 97bp與 32bp兩條帶.每次酶切反應設有陽性對照,保證酶切的準確性(見圖2)。

(4)PCR產(chǎn)物測序,見圖3。

圖2 酶切產(chǎn)物電泳圖

圖3 此標本為 6A/6A型其中的一條鏈測序圖

1.3 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 13.0分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以±s表示,采用非配對 t檢驗;計數(shù)資料以百分比表示,采用 χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 病例組與對照組危險因素比較

兩組平均年齡無明顯差別,而病例組中男性,高血壓病史,糖尿病病史及吸煙史明顯多于對照組(P＜0.05)。高血脂病史及飲酒史兩組之間無明顯差別(見表1)。

2.2 平衡檢驗

病例組與對照組等位基因頻率均符合 Hardy-Weinberg平衡=2.12,P＞0.05=3.22,P＞0.05)。

2.3 兩組 MMP-3基因型及等位基因頻率比較

MMP-3基因型和等位基因頻率在兩組之間分布無明顯差別(P＞0.05)。所有高血壓病,糖尿病,有吸煙史及有相應臨床癥狀患者病例組和對照組之間分別進行基因型和等位基因頻率比較,差別無顯著性 (P＞0.05)(見表2、表3)。

表1 病例組與對照組危險因素比較

表2 MMP-3在各類病例組與對照組的基因型頻率及其相關性分析

表3 MMP-3在各類病例組與對照組的等位基因頻率及其相關性分析

3 討 論

MMPs是高度保守的依賴于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族,可降解基底膜和細胞外基質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)。目前認為,血管重建是動脈粥樣硬化和血管再狹窄的主要病理學過程[2],而 MMPs在血管重建中起著非常重要的作用[3]。

MMP-3又稱基質(zhì)溶解素 1,可降解Ⅱ、IV、IX型膠原,層粘連蛋白,纖維結(jié)合蛋白,蛋白聚糖,彈力蛋白和明膠劑等底物,并可激活其他 MMP,如激活MMP-1前體成為 MMP-1,而 MMP-1可降解Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ型膠原,所以 MMP-3在 MMP家族激活過程中具有關鍵作用。MMP-3基因位于染色體 11q22.3,其存在多種基因多態(tài)性,但 MMP-3單倍體效應主要取決于啟動子區(qū)域-1171 bp5A/6A基因多態(tài)性[4]。體外培養(yǎng)纖維母細胞和血管平滑肌細胞實驗表明 5A等位基因比 6A等位基因具有更高活性,光譜移位分析顯示一種抑制轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白與 6A結(jié)合更緊密,因此提示攜帶 6A等位基因的人群由于轉(zhuǎn)錄活性降低,表達減少,從而使得細胞外基質(zhì)積累,導致動脈粥樣硬化形成[5]。在腦動脈粥樣硬化等原因引起的血管病變基礎上,管腔狹窄、閉塞或有血栓形成,造成局部腦組織缺血。

本研究的結(jié)果顯示在本研究組中 5A和 6A等位基因頻率分別為 0.16和 0.84,與其他西方學者報告的頻率分布有所不同,5A純合子基因型明顯較少;但與國內(nèi)關于 MMP-3基因多態(tài)性與疾病的研究中等位基因頻率相似[6,7];MMP-3啟動子區(qū)-1171 5A6A基因多態(tài)性與大腦中動脈狹窄無明顯關聯(lián)。但病例組性別,高血壓病病史,糖尿病病史,吸煙史與對照組比較有統(tǒng)計學意義?？梢哉f明 MMP-3啟動子區(qū) 5A/6A多態(tài)性可能不是大腦中動脈狹窄的獨立危險因素,而更證實了性別,高血壓病史,糖尿病病史及吸煙史在大腦中動脈狹窄形成中起著重要作用。同時頸動脈內(nèi)-中膜厚度(Intima media thickness,IMT)在兩組之間分布有明顯差別(P＜0.05),有證據(jù)顯示[8],頸動脈 IMT是動脈粥樣硬化早期可靠的檢測指標。故頸動脈 IMT可作為大腦中動脈狹窄的一個標識。

大約 18年前,Henney等人就發(fā)現(xiàn)在人類動脈粥樣硬化斑塊中有編碼 MMP-3的信使 RNA表達[9]。關于無動脈粥樣硬化危險因素的健康白種人的研究顯示,6A等位基因與頸動脈內(nèi)膜厚度增加有關聯(lián)[10,11]。與此同時曼哈頓島對未患卒中的西班牙人的研究也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果[12],意大利同樣發(fā)現(xiàn)MMP-3 5A/5A基因多態(tài)性 6A6A基因型與頸動脈狹窄存在一定關聯(lián)[1]。但是在對金屬蛋白酶-3基因多態(tài)性與糖尿病患者頸動脈重構(gòu)的關聯(lián)性研究中發(fā)現(xiàn),其 5A/6A多態(tài)性與正常人群中頸動脈重構(gòu)有關,而在糖尿病患者中并未發(fā)現(xiàn)明顯相關性[13]。國內(nèi)有關 MMP-3 5A/6A基因多態(tài)性與冠心病關系的研究中認為其基因多態(tài)性與冠心病,心肌梗死危險性無明顯相關[6],及關于基質(zhì)金屬蛋白酶-3啟動子基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的研究[14]與本研究結(jié)果一致。分析原因可能有以下幾點:(1)種族不同。國外研究的多為白種人,本研究的研究對象是中國北方漢族人群,兩種人群的生活及飲食習慣完全不同,觀察國外 5A等位基因頻率分布明顯高于國人,考慮人種為不可忽視的一個因素。(2)研究對象是否有動脈粥樣硬化危險因素。激素、生長因子、化學性病因、細胞因子、生理應激及癌細胞等等均可影響MMPs的轉(zhuǎn)錄。故吸煙,高血壓或糖尿病等危險因素可能通過某種途徑影響 MMP-3的轉(zhuǎn)錄,導致陰性結(jié)果,但 Giorgio Ghilardi[1]等對 MMP-3 6A/5A多態(tài)性與頸內(nèi)動脈狹窄的研究對象中有以上危險因素,同樣有關聯(lián),與此觀點不一致。(3)本研究中的研究對象數(shù)量有限,可能存在抽樣誤差。因此需進行更大樣本的研究以進一步論證。

總之,本研究顯示 MMP-3啟動子-1171 5A/6A基因多態(tài)性不能作為北方漢族人群大腦中動脈狹窄的一個獨立危險因素,可能在其他基因位點有與之相關的多態(tài)性,而性別、高血壓、糖尿病、吸煙史是大腦中動脈狹窄的危險因素,提示對腦血管狹窄或腦血管病應積極進行一級預防和二級預防。在今后對血管狹窄的研究中,應擴大樣本量,收集更為匹配的研究對象,減少誤差。同時注意人種問題,不同的人種發(fā)病機制可能有所不同。

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