張艷梅, 呼格吉樂(lè), 馬飛煜, 鄔 偉, 馬翔凌

帕金森病(Parkinson's Disease,PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性病,其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制涉及多基因表達(dá)改變[1]。盡管 PD的發(fā)病機(jī)制目前仍不完全清楚,但一些誘發(fā)因素在不同階段作用于不同基因,引起相關(guān)基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)水平改變而致病。MPPs的主要功能是特異識(shí)別一大類線粒體前體蛋白,并在單一和特定位點(diǎn)剪切這類蛋白,很可能與 PD有關(guān)[2]。在本研究的前期工作中利用蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)MPP+誘導(dǎo)的 PC12細(xì)胞 PD模型中發(fā)現(xiàn)線粒體加工肽酶(m itochondrial processing peptidases,MPPs)表達(dá)量變化顯著[3],因此本研究采用干擾 RNA技術(shù)特異性剔除或關(guān)閉 MPP+基因的表達(dá),使培養(yǎng)細(xì)胞中的靶定基因沉默。因此本實(shí)驗(yàn)針對(duì) Pmpca基因,設(shè)計(jì)并構(gòu)建 siRNA(small interference RNA,siRNA)表達(dá)載體,為進(jìn)一步在體內(nèi)外研究 MPPs的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

PC12細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);AXYGEN質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)于杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司;BamH I、Bbs I購(gòu)自 sigma公司;干擾 RNA的合成購(gòu)自上海吉瑪公司;測(cè)序工作在上海 Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成

因國(guó)內(nèi)外對(duì) Pmpca-siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建,未見(jiàn)報(bào)道。本研究根據(jù) Pmpca的所有變異體的共同序列設(shè)計(jì)出 shRNA,經(jīng) blast軟件進(jìn)行同源搜索,確定其特異性。以下序列為 Pmpca部分 cDNA序列,黑體部分為靶序列即干擾部位。

shRNA模板中的 loop結(jié)構(gòu)選用了 TTCAAGAGA以避免形成終止信號(hào),shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)。正義鏈模板的 5'端添加了 CACC,與 BbsI酶切后形成的粘端互補(bǔ);反義鏈模板的 5'端添加了GATC,與 BamHI酶切后形成的粘端互補(bǔ);如果 siRNA的第一個(gè)堿基不是 G,則在 CACC后補(bǔ)加一個(gè)G,以下是以 SR-Pmpca-1425為例具體說(shuō)明模板的設(shè)計(jì)。

1.2.2 shRNA模板的退火

將 DNA oligo分別用 TE(pH 8.0)溶解,濃度為100μmol/L。取相應(yīng)的正義鏈和反義鏈 oligo溶液。退火條件：95℃ 5min;85℃ 5min;75℃ 5m in;70℃5min;4℃保存。退火處理后得到濃度為 10μM的shRNA模板。將所得模板溶液稀釋 500倍,終濃度為 20nmol/L,用于連接反應(yīng)。

1.2.3 PGPU6/GFP/Neo載體的線性化

圖1 PGPU6/GFP/Neo載體圖

取 2μg PGPU6/GFP/Neo載體進(jìn)行酶切處理：37℃酶切1h,瓊脂糖電泳,使用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0(TaKaRa)回收,電泳檢測(cè)估算濃度,稀釋濃度至 50ng/ul。

1.2.4 PGPU6/GFP/Neo-shRNA載體的構(gòu)建

(1)載體的連接反應(yīng)：22℃ 1h,轉(zhuǎn)到 JM109感受態(tài)細(xì)胞中。

(2)每個(gè)連接反應(yīng)挑取 5個(gè)菌落,接種到含50μg/ml Kanamycin的 LB培養(yǎng)基中,37℃孵育過(guò)夜。挑取過(guò)夜培養(yǎng)平板上單個(gè)菌落置于 5ml含卡那霉素(30μg/m L)的 LB培養(yǎng)基中,37℃,250r/min振蕩培養(yǎng)12h。

(3)質(zhì)粒提?。喝?5m l在 LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液于離心管中,室溫 11200r/min離心 1min,棄盡上清;用 250μl已加入 RNase A的 Buffer S1懸浮細(xì)菌沉淀,加入 250μl Buffer S2,翻轉(zhuǎn)混合 4～6次,混合均勻,使菌體充分裂解,形成透亮的溶液。加入350μl Buffer S3,翻轉(zhuǎn)混合 6～8次,11200r/min離心10min;吸取離心上清并轉(zhuǎn)移到 DNA制備管中,11200r/min離心 1m in,棄濾液;將制備管置回離心管 ,加 500μl BufferW1,11200r/min離心 1min,棄濾液;將制備管置回離心管,加 700μl Buffer W2,11200r/min離心 1m in,棄濾液;以同樣的方法再用700μl BufferW 2洗滌 1次。確認(rèn)在 Buffer W2 concentrate中已按試劑瓶上的指定體積加入無(wú)水乙醇;將制備管置回 2m l離心管中,11200r/min離心1min;將制備管移入新的 1.5ml離心管中,在 DNA制備管膜中央加 60～80μl Eluent或去離子水,室溫靜置 1min。 11200r/m in離心 1min。將 Eluent或去離子水加熱至 65℃將提高洗脫效率;使用堿裂解法抽提質(zhì)粒,所得質(zhì)粒用 Bam H I,Pst I分別酶切鑒定(見(jiàn)圖2、圖3),測(cè)序鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒酶切

使用堿裂解法抽提質(zhì)粒,所得質(zhì)粒用 Bam H I,Pst I分別酶切鑒定,陽(yáng)性重組載體應(yīng)該可以被BamH I切開(kāi),而不能被 Pst I切開(kāi)。酶切結(jié)果表明,所有質(zhì)粒均為陽(yáng)性重組載體(見(jiàn)圖2、圖3)。

2.2 測(cè)序鑒定

每組選擇兩個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。構(gòu)建的 siRNAs序列與基因庫(kù)中序列完全相同,并且未發(fā)現(xiàn)有突變、缺失、插入等異常存在。

圖2 重組載體的酶切鑒定

圖3 重組載體的酶切鑒定

3 討 論

RNAi技術(shù)的基本原理是將雙鏈 RNA(doublestranded RNA,dsRNA)裂解為 21～25個(gè)核苷酸組成的 siRNA作為介導(dǎo)子,引起同源序列特異性的 mRNA降解[4]。siRNA是 RNA干擾過(guò)程中的重要中間分子。體外制備的方法包括直接化學(xué)合成或利用Dicer或 RNA酶Ⅲ消化長(zhǎng)的 dsRNA,也可利用質(zhì)粒和病毒載體構(gòu)建載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[5]。RNAi技術(shù)近年來(lái)發(fā)展迅速,已成為分子生物學(xué)研究的主要技術(shù)手段之一,如 siRNA脂質(zhì)體介導(dǎo)法[6],抑制艾滋病病毒[7,8]癌癥的早期發(fā)現(xiàn)[9]等,已逐漸被應(yīng)用于人類基因功能研究和基因治療方面。當(dāng)然,開(kāi)發(fā)這類RNAi治療需要花費(fèi)幾年甚至更長(zhǎng)的時(shí)間,但隨著研究的不斷深入將會(huì)有更多以 RNAi機(jī)制為基礎(chǔ)的治療手段被用于臨床[10]。

線粒體加工肽酶(mitochond rial processing peptidases,MPPs)是一種金屬內(nèi)切蛋白酶[11],它也是由 α和 β兩個(gè)亞單位組成的可溶性的異源二聚體,分子量是 100～110kD。MPPs的主要功能是特異識(shí)別一大類線粒體前體蛋白,并在單一和特定位點(diǎn)剪切這類蛋白。目前關(guān)于 MPPs與神經(jīng)系統(tǒng)變性病的研究開(kāi)展很少,但從上述研究中可以看出,MPPs與神經(jīng)變性病的發(fā)生有著一定的聯(lián)系,但在國(guó)內(nèi)外 PD研究的相關(guān)文獻(xiàn)中未見(jiàn)該蛋白的報(bào)道。張艷梅等[3]研究首次發(fā)現(xiàn) MPPs蛋白在 PD的發(fā)病中可能起一定的作用,值得深入研究以闡明其詳盡的作用機(jī)制。

本研究通過(guò)構(gòu)建 shRNA的真核表達(dá)載體,旨在為帕金森病的基因治療提供一種有效手段。MPPs真核表達(dá)載體的構(gòu)建未見(jiàn)報(bào)道。本研究根據(jù)該基因的所有變異體的共同序列設(shè)計(jì)出 shRNA,經(jīng) blast軟件進(jìn)行同源搜索,確定其特異性,模板為含有靶點(diǎn)序列回文結(jié)構(gòu),這樣細(xì)胞內(nèi)合成的 RNA為發(fā)夾樣雙鏈結(jié)構(gòu),可產(chǎn)生分子內(nèi)莖-環(huán)結(jié)構(gòu),被內(nèi)源性 Dicer酶處理成 21nt的雙鏈 siRNA,發(fā)揮 siRNA的效應(yīng),達(dá)到特異性抑制靶基因表達(dá)的目的。再用 PAGE方式純化,確定其準(zhǔn)確性。通過(guò)與真核表達(dá)載體PGPU6/GFP/Neo連接,酶切鑒定和基因測(cè)序證明 MPPs特異性 siRNA真核表達(dá)載體 PGPU6/GFP/Neo-Pmpca-SR-1113、PGPU6/GFP/Neo-Pmpca-SR-1425、PGPU6/GFP/Neo-Pmpca-SR-561、PGPU6/GFP/Neo-Pmpca-SR-903構(gòu)建成功。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究 MPPs基因功能缺陷對(duì) PC12細(xì)胞的侵襲、增值的影響,以及雙向電泳探究基因功能缺陷后蛋白的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

[1]李淑娟,胡國(guó)華,過(guò)紅明,等.白介素-1β和小膠質(zhì)細(xì)胞在帕金森病中的作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2009,29(5)：1189-1191.

[2]Taylor AB,Smith BS,Kitada SJ,etal.Crystal structuresofmitochondrial processing peptidase reveal the mode for specific cleavage of import signal sequences[J].Structure Cambridge,2001,9(7)：615-625.

[3]張艷梅,馬飛煜,胡林森,等.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定帕金森病模型中的 3種新蛋白質(zhì)[J].國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志,2008,35(4)：291-294.

[4]呼格吉樂(lè),王震宇,王文禮,等.RNAi技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J].疾病監(jiān)測(cè)與控制雜志,2009,25(1)：61-63.

[5]Stockinger A,Eger A,Wolf J,etal.E-cadherin regulates cell growth bymodulating proliferation-dependent beta-catenin transcriptional activity[J].Cell Biol,2001,154(6)：1185-1196.

[6]Durcan N,Murphy C,Cryan SA.Inhalable siRNA：potentialas a therapeutic agent in the lungs[J].Mol Pharm,2008,5(4)：559-566.

[7]Kumar P,Ban HS,Kim SS,etal.T cell-specific siRNA delivery suppresses HIV-1 infection in humanized mice[J].Cell,2008,134(4)：577-586.

[8]Liu YP,Gruber J,Haasnoot J,etal.RNAi-mediated inhibition of HIV-1 by targeting partially complementary viral sequences[J].Nucleic Acids Res,2009,37(18)：6194-6204.

[9]Quon K,Kassner PD.RNA interference screening for the discovery of oncology targets[J].Expert Opin Ther Targets,2009,13(9)：1027-1035.

[10]Grosshans H,Filipowicz W.Molecular biology：the expanding world of small RNAs[J].Nature,2008,451(7177)：414-416.

[11]Oleksandr G,Patrizia C,Grazia I.Mitochondrial processing peptidases[J].Biochim Biophy Acta,2002,1592(1)：63-77.