胡 柯, 余國(guó)龍, 歐雅莉, 涂秋云, 楊天倫

近年國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明干細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中能有效改善或恢復(fù)腦卒中等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病所損害的神經(jīng)功能,其中多數(shù)研究是應(yīng)用骨髓間質(zhì)干細(xì)胞為移植細(xì)胞[1]。近期國(guó)內(nèi)外有研究者嘗試采用經(jīng)顱腦內(nèi)直接或靜脈移植人臍血細(xì)胞(HUCBCs)移植治療腦缺血,也證實(shí)有與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞相似的療效[2,3],但上述研究均采用血壓正常、缺乏腦血管基礎(chǔ)病變的 SD或 Wister大鼠制備腦缺血實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本研究采用有腦血管病變基礎(chǔ)的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)制備腦缺血實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?觀察經(jīng)靜脈移植 HUCBCs對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)損傷、腦組織梗死面積的影響;探討 HUCBCs靜脈移植治療局灶性腦缺血的療效及其機(jī)制,為臍血細(xì)胞在人類缺血性心腦血管疾病治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 84只 2～3m齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(體重 250±30g),由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。每只大鼠至少測(cè)量 10次尾動(dòng)脈壓,收縮壓平均值均在 160mmHg以上。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料 人臍血標(biāo)本取自湖南省婦幼保健院產(chǎn)科健康妊娠產(chǎn)婦,IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基、淋巴細(xì)胞分離液、氯化三苯基四氮咪(TTC)、DAPi、瓊脂糖 、臺(tái)盼藍(lán) 、鼠抗 BDNF單克隆抗體、TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTPMix脫氧核苷酸、DNA分子量 marker等。

1.2 方法

1.2.1 HUCBCs的分離、培養(yǎng)以及 DAPi染色

(1)HUCBCs的體外分離、純化和培養(yǎng)參照 6%HES法[4]。(2)DAPi標(biāo)記:移植前 1d取 P3代細(xì)胞,10μg/ml DAPi的 IMDM培養(yǎng)基過(guò)夜;(3)移植細(xì)胞收集:移植前1h離心HUCBCs,PBS清洗掉未結(jié)合的 DAPi,調(diào)整懸液細(xì)胞密度為 1×106/ml。(4)HUCBCs活性檢測(cè):移植前取 1滴細(xì)胞懸液,2%臺(tái)盼藍(lán)染色,顯微鏡觀察。

1.2.2 大鼠局灶性腦缺血再灌注模型建立與實(shí)驗(yàn)分組 SHR參照 Zea Longa線栓法[5]建立MCAO模型。術(shù)后 24h參照 Bederson法[6]對(duì)存活大鼠行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,評(píng)分 1分以上者定為造模成功。100只 SHR造模成功 68只(68.0%),術(shù)中術(shù)后死亡 24只,造模失敗 8只。術(shù)后 48h造模成功的SHR隨機(jī)分配入治療組與對(duì)照組各 34只。

1.2.3 HUCBCs移植 移植過(guò)程在無(wú)菌條件下進(jìn)行,MCAO術(shù)后 48h對(duì)大鼠進(jìn)行 HUCBCs移植。10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉,20%甘露醇 0.5ml,1ml 1×106個(gè) HUCBCs先后經(jīng)尾靜脈注入治療組大鼠,對(duì)照組注射甘露醇后,繼之同體積HUCBCs細(xì)胞培養(yǎng)基注射。

1.2.4 腦梗死面積檢測(cè) 移植后 3、14、28d分別隨機(jī)取治療對(duì)照組 SHR各 5只,Bederson評(píng)分后按照以下步驟處理:10%水合氯醛深度麻醉,37℃生理鹽水心內(nèi)灌注,迅速取腦,冰凍 30min,冠狀位間隔 2mm連續(xù)做 5等份切片,置入 2%TTC避光染色20min,10%甲醛溶液固定過(guò)夜。腦組織標(biāo)本平鋪照相后,德國(guó) KONTRON-IBAS2.5自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算梗死范圍占全腦面積的百分比。

1.2.5 腦組織標(biāo)本 DAPi標(biāo)記細(xì)胞示蹤 移植后 3、14、28d分別隨機(jī)取治療和對(duì)照組各 2只 SHR取大腦后浸于多聚甲醛液固定,冠狀位冰凍切片,片厚 50um。選擇含梗死灶部位腦組織連續(xù)冠狀切片 5張,熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)梗死側(cè)與正常側(cè)腦組織 DAPi標(biāo)記陽(yáng)性藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)平均值。

1.2.6 腦組織標(biāo)本 BDNF免疫組化以及 mRNA表達(dá)的測(cè)定 移植后 3、14、28d分別隨機(jī)取治療和對(duì)照組 SHR各 3只,取腦組織,石蠟包埋,連續(xù)冠狀位切片,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)行 BDNF抗體兩步法免疫組化染色,光鏡下計(jì)數(shù)每切片梗死側(cè)與正常側(cè)腦組織 BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)平均值。14,28d時(shí)再隨機(jī)選取治療和對(duì)照組中大鼠各 2只,取缺血壞死核心區(qū)部位大腦組織,常規(guī)提取 RNA并行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成 cDNA。用 Primer軟件設(shè)計(jì)引物序列,用 β-actin為內(nèi)參基因,行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)。產(chǎn)物和 DNA Marker于瓊脂糖凝膠中電泳,凝膠掃描系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。計(jì)算 BDNF與 β-actin產(chǎn)物 OD比值,做為BDNFmRNA表達(dá)的半定量結(jié)果,重復(fù)測(cè)量 5次并取平均值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多樣本均數(shù)比較采用方差分析,兩組比較采用 t檢驗(yàn),所有測(cè)定值用±s表示,P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差別顯著。

2 結(jié) 果

2.1 HUCBCs移植對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能和腦梗死面積的影響

兩組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和兩組腦梗死面積百分比比較見(jiàn)表1、圖1、圖2。移植后 3d兩組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死面積百分比無(wú)顯著差別,但移植后14、28d,治療組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死面積均明顯低于對(duì)照組和移植后 3d的治療組 (p＜0.05)。

2.2 大鼠腦組織 DAPi HUCBCs陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)

治療組移植后 3d梗死側(cè)見(jiàn)少量藍(lán)色熒光 DAPi陽(yáng)性染色細(xì)胞(見(jiàn)圖3),與 3d比較,移植后 14、28d時(shí)梗死側(cè)陽(yáng)染細(xì)胞計(jì)數(shù)增加(見(jiàn)表2、圖4)(P＜0.05)。

2.3 BDNF免疫組化及 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

光鏡下 BDNF陽(yáng)染細(xì)胞呈棕黃色,主要位于治療組和對(duì)照組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)下及海馬等處。移植后各時(shí)間點(diǎn) BDNF染色陽(yáng)性細(xì)胞比較見(jiàn)表3,對(duì)照組缺血側(cè)各時(shí)間點(diǎn) BDNF染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著高于其正常側(cè),治療組缺血側(cè)各時(shí)間點(diǎn) BDNF染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著高于其正常側(cè)和對(duì)照組缺血側(cè)(見(jiàn)圖5、圖6)。圖7為治療組與對(duì)照組大鼠缺血側(cè)腦組織 BDNF mRNA凝膠電泳圖,BDNFmRNA擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為 259bp,位于凝膠近端,β-actin產(chǎn)物長(zhǎng)度約為 90bp,位于遠(yuǎn)端。凝膠掃描系統(tǒng)分析各組 BDNF mRNA表達(dá)的半定量值,14d時(shí)治療組為 0.62±0.13,對(duì)照組為 0.42±0.09;28d時(shí)治療組為 0.72±0.08,對(duì)照組為 0.50±0.10。相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)治療組BDNF mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組(P＜0.05)。

表1 各時(shí)間點(diǎn)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和梗死灶面積百分比比較

表2 各時(shí)間點(diǎn)移植組大鼠腦組織DAPi示蹤細(xì)胞計(jì)數(shù)

表3 各時(shí)間點(diǎn)治療組、對(duì)照腦組織免疫組化BDNF陽(yáng)性染色細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

圖1 28d治療組鼠腦組織 TTC染色

圖2 28d對(duì)照組鼠腦組織 TTC染色

圖3 3d熒光顯微鏡下 DAPi陽(yáng)性細(xì)胞(10×10倍)

圖4 28d熒光顯微鏡下 DAPi陽(yáng)性細(xì)胞(10×10倍)

圖5 14d治療組缺血損傷周?chē)X組織 BDNF免疫組化染色(10×10倍光鏡下)

圖6 14d時(shí)對(duì)照組缺血損傷周?chē)X BDNF免疫組化染色(10×10倍光鏡下)

圖7 治療組與對(duì)照組大鼠缺血側(cè)腦組織 BDNF mRNA凝膠電泳圖

3 討 論

本研究采用有腦血管病變基礎(chǔ)的 SHR制備腦缺血實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?以探討經(jīng)靜脈移植 HUCBCs對(duì)局灶性腦缺血大鼠的治療療效及其機(jī)制,目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)類似報(bào)道。本研究結(jié)果證實(shí)對(duì) SHR采用線栓法制備局灶性腦缺血/再灌注模型成功率較高,梗死部位主要集中于 MCA供血區(qū)紋狀體、皮質(zhì)下白質(zhì)和部分皮質(zhì),并且神經(jīng)功能損傷肯定。已有研究[7]顯示 SHR腦血管解剖結(jié)構(gòu)與人類相近,而且具有與人類高血壓病相似的腦血管病理變化基礎(chǔ)。故用其制備局灶性腦缺血模型,可能更接近接近人類腦血栓形成發(fā)病或腦缺血及缺血再灌注過(guò)程,其實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床更有指導(dǎo)意義。

Ha等研究證實(shí)超過(guò) 60%的 HUCBCs在表達(dá)CD133的同時(shí)亦有 Nestin的表達(dá)[8],說(shuō)明 HUCBCs可向神經(jīng)細(xì)胞方向分化;Borlongan等研究[9]顯示臍血干細(xì)胞移植后鼠卒中模型神經(jīng)功能缺失得以改善。與目前大多數(shù)研究采用的骨髓干細(xì)胞比較,HUCBC有以下優(yōu)勢(shì)[10]:(1)采集簡(jiǎn)單、來(lái)源廣泛,對(duì)孕婦和嬰兒無(wú)風(fēng)險(xiǎn);(2)對(duì) HLA不合抗原易耐受,組織配型要求低,宿主抗移植物反應(yīng)和移植物抗宿主反應(yīng)的發(fā)生率低和程度輕;(3)臍血干細(xì)胞有較強(qiáng)的自我繁殖能力,臨床應(yīng)用治療血液病等已 20年,安全可靠,利于今后臨床推廣應(yīng)用。

雖然經(jīng)顱腦內(nèi)細(xì)胞移植是細(xì)胞移植治療腦梗死等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病經(jīng)典途經(jīng),但近期 Willing等[11]對(duì) MCAO腦梗死實(shí)驗(yàn)大鼠分別經(jīng)靜脈或經(jīng)顱腦內(nèi)移植 HUCBC,發(fā)現(xiàn)治療 2m后只有經(jīng)靜脈移植的實(shí)驗(yàn)大鼠階梯運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)指標(biāo)明顯改善。本研究是經(jīng)靜脈移植 HUCBCs,結(jié)果表明能顯著改善 SHR局灶性腦缺血神經(jīng)功能,減低腦組織梗死面積;且療效以移植后 14～28d更為顯著。綜合上述至少可以說(shuō)明經(jīng)體循環(huán)移植是對(duì)腦梗死進(jìn)行細(xì)胞移植治療另一有效途徑,其方法簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)、能大劑量、重復(fù)移植,易被患者接受,適于今后臨床推廣應(yīng)用。

本研究還對(duì) HUCBCs經(jīng)靜脈移植治療 SHR局灶性腦缺血療效機(jī)制進(jìn)行初步探討。結(jié)果顯示 DAPi陽(yáng)性染色細(xì)胞主要分布在梗死側(cè)腦組織,移植后14～28d陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)增多;證實(shí)了經(jīng)靜脈移植HUCBCs能通過(guò)血腦屏障遷入腦組織內(nèi),還能在內(nèi)增殖。本研究結(jié)果還顯示治療組 BDNF陽(yáng)染細(xì)胞主要位于缺血側(cè)大腦皮質(zhì)下以及海馬等處,BDNF陽(yáng)染細(xì)胞數(shù)均高于其正常側(cè)和對(duì)照組缺血側(cè),且移植后 14,28d治療組缺血側(cè)腦組織 BDNF mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組。綜合上述結(jié)果表明HUCBCs經(jīng)靜脈移植能遷入受損腦組織并在其內(nèi)增殖,促進(jìn)自分泌或旁分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子產(chǎn)生增加,這可能與 SHR腦缺血再灌注損傷神經(jīng)功能的改善以及腦梗死面積的縮小有關(guān)。目前 HUCBCs靜脈移植對(duì)腦缺血再灌注損傷的療效機(jī)制還未完全明了,可能的機(jī)制是:(1)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)缺血損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用,HUCBCs經(jīng)靜脈移植遷入至腦組織,能通過(guò)自分泌或旁分泌產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如 BDNF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等[9];(2)部分移植細(xì)胞增殖、分化為神經(jīng)細(xì)胞[12];(3)促進(jìn)局部新生血管形成[13]。

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