白春艷, 孫宏俠, 劉 敏, 周 艷, 齊英斌, 李宗樹, 張明明, 江新梅

阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)是一種發(fā)生在老年期的神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病,其病因迄今不明。臨床表現(xiàn)主要為認知(計算、判斷、綜合等)功能障礙、記憶力減退、人格異常等。病理特征為彌散性大腦皮質萎縮、神經(jīng)元外老年斑(senile plaques,SP)沉積、神經(jīng)元內神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)形成、神經(jīng)元缺失等。目前診斷 AD主要根據(jù)患者病史、癥狀、神經(jīng)心理學測試、排除其他類型癡呆等,只有待患者死后尸解才能確診。而 AD主要發(fā)生于老年人,如果能早期診斷,采取一定的防治措施,可改善其預后。為此,國內外學者做了大量的研究,以期找到 AD特異性的早期診斷指標。對于老年人,無創(chuàng)性診斷顯得尤為重要,相比腦脊液檢查,尿液檢查顯得更為容易。國外研究表明,阿爾茨海默病相關神經(jīng)絲蛋白(AD7c-NTP)在 AD患者的神經(jīng)元纖維纏結(NFT)中大量存在,并在患者腦中呈分泌性上調表達,因此,推測它可能與 AD的病理過程有關[1～3]。增高的 AD7c-NTP可從早期或相對嚴重的 AD患者腦脊液及尿樣本中檢測到,而且腦脊液及尿液中 AD7c-NTP水平與癡呆的嚴重程度相關[4～6]。另有研究[7]發(fā)現(xiàn),AD患者尿樣中 AD7c-NTP的檢測能達到與腦脊液檢測相同的效果。本研究對 AD患者尿樣中 AD7c-NTP含量進行測定,并和血管性癡呆患者以及智能正常老年人尿樣中的 AD7c-NTP含量進行比較統(tǒng)計,試圖找出尿中 AD7c-NTP含量與 AD的關系,從而為AD的早期診斷提供一種比較容易接受的、簡便的無創(chuàng)檢測方法。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 2006年 ～2009年就診于吉林大學第一醫(yī)院及吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)內科的癡呆患者 96例,分為 AD組和 VD組,AD組患者 46例,其中男 24例 、女 22例,年齡 60～83歲,平均 72.5±6.2歲。 VD組 50例,男 26例,女 24例,年齡 61 ～82歲,平均 72.5±6.6歲。全部病例均進行系統(tǒng)的病史采集、?？撇轶w及癡呆系列量表測試,包括簡易智能狀態(tài)檢查量表(MMSE)、臨床癡呆評定量表(CDR)以及 Hachinski缺血指數(shù)量表(HIS),所有病例均行頭部 CT和(或)MRI檢查。AD組的納入標準:按照美國精神醫(yī)學會的《精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊》第 IV版標準診斷癡呆,很可能 AD采用美國國立神經(jīng)病、語言障礙和卒中研究院(NINCDS)-阿爾茨海默病和相關疾病學會(ADRDA)的診斷標準[8];Hachinski缺血量表評分≦ 4分;頭部 CT和(或)MRI檢查以及有關的實驗室檢查以排除其他原因引起的癡呆;MMSE檢查(中學以上≦ 24分,小學≦ 20分,文盲≦ 17分);CDR 1～2分。 VD組患者均符合DSM-IV關于VD的診斷標準;曾有卒中發(fā)作史,有急性或亞急性發(fā)病的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征,病情呈階梯樣進展,CT或 MRI證實腦內有多發(fā)梗死灶。智能正常中老年對照組 122例,男 59例,女63例,年齡 41～95歲,平均 72.8±7.6歲。智能檢查均正常。年齡匹配的健康查體中老年人,無心腦血管疾病,且血壓、心電圖正常,血常規(guī)、血糖及血脂均在正常范圍。無神經(jīng)系統(tǒng)體征及明顯的肝、腎或內分泌疾病。根據(jù)頭部 CT及 MRI,排除頭部占位性病變及感染。

1.1.2 儀器與試劑 兔抗人 AD7c-NTP多克隆抗體由首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院中心實驗室提供;Spectra Max M5酶標儀系美國 Molecular Devices公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 留取晨尿的中段尿,混勻,肉眼觀察,如尿液渾濁或顏色很深,應棄去,選取清亮的標本進行尿常規(guī)測定。凡有如下的一種異常,即為不合格標本:(1)24h尿蛋白量小于 40mg或大于 2000mg;(2)尿中的 WBC、RBC異?；蛴屑毦L;(3)尿中有結晶;(4)尿比重異常;(5)pH異常;(6)糖、酮體、硝酸鹽、膽紅素或尿膽原陽性。留取合格尿標本,400r/min,離心 5min,以專用塑料試管立即存于 -20℃待測(保存不超過 1w)。

1.2.2 蛋白的提取 取尿液標本加入 5倍體積提取緩沖液,混勻后加入 3倍體積純水,10000r/min,4℃離心 3min。棄去上層水相,加入 500μl無水乙醇,10000r/min,4℃離心 2min,收集沉淀。

1.2.3 蛋白含量的測定 以包被緩沖液溶解上述沉淀,4℃濕盒包被過夜。1%BSA封閉后,依次加入兔抗人 AD7c-NTP抗體和 HRP標記的山羊抗兔 IgG,TMB顯色。終止反應后,檢測 A450。以購買的 AD7c-NTP制備標準曲線,測定樣品中蛋白含量。

2 結 果

2.1 各組尿中 AD7c-NTP含量比較 AD組、VD組及智能正常老年對照組尿液中 AD7c-NTP含量分別為(33.35±1.61)、(18.19±1.41)、(18.30±1.45)μg/ml,見表1及圖1。AD組明顯高于其他兩組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001),而 VD組與智能正常老年對照組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2 各組尿中 AD7c-NTP含量與年齡及性別的關系 圖2顯示所有 3組中 AD7c-NTP含量與年齡的關系,擬合優(yōu)度判定系數(shù)(R2)僅為 0.019,證明 AD7c-NTP含量與年齡無關。圖3顯示 AD7c-NTP含量與性別的關系,變異度檢驗 P=0.73,證明AD7c-NTP含量與性別無關。

2.3 尿液中 AD7c-NTP含量對 AD診斷的敏感度及特異性對比 將 VD組和智能正常老年組合并為一個對照組,為 non-AD(非阿爾茨海默病)組。以尿液中不同的 AD7c-NTP含量為診斷界值,其診斷 AD的特異性隨敏感性的增強而呈現(xiàn)出下降趨勢。其中,以 22μg/ml作為診斷標準時,其診斷的敏感性為 89%,同時特異性可以達到 90%,均達到了比較高的水平,見圖4。

表1 各組尿中AD7c-NTP含量及年齡對比

圖1 各組尿中 AD7c-NTP含量散點圖

圖2 3組尿液標本中 AD7c-NTP含量與年齡的關系(R2=0.019)

圖3 3組尿液標本中 AD7c-NTP含量與性別的關系(P=0.73)

圖4 尿中 AD7c-NTP含量診斷AD的敏感度及特異性的對比

3 討 論

目前,AD診斷的準確率只有 70%左右,載脂蛋白 Eε4等位基因作為 AD的危險因子只在 50%的AD中出現(xiàn)[9]。而且檢測腦脊液和血清中的 β淀粉樣蛋白在 AD與非 AD病例有明顯重疊,其應用受到限制[1]。此外,其他潛在的生物學標記也已開展研究,例如 8-羥基-2-脫氧鳥苷[10]和血紅素加氧酶-1[11],但這些檢查尚未得到臨床驗證。

為了精確并能夠早期診斷 AD,同時作為療效判斷的可靠指標,需要一種可靠的周圍生物標記[12]。而且,早期診斷 AD并采取一定的防治措施,可明顯改善其預后。近年國外研究發(fā)現(xiàn),在 AD患者的腦組織,腦脊液及尿液中 AD7c-NTP的表達水平選擇性增加,對于 AD的早期診斷其敏感性及特異性在 90%以上[13],AD7c-NTP表達水平的這種變化使它成為 AD早期診斷的生物標記,越來越引起科學家的關注。

AD7c-NTP是一種分子量為 41kD的跨膜磷蛋白,在神經(jīng)元胞體中表達,AD患者腦內選擇性升高,其功能與神經(jīng)炎的萌發(fā)及細胞死亡有關[14]。研究表明,增高的 AD7c-NTP可從早期或相對嚴重的AD患者腦脊液及尿樣本中檢測到,而且腦脊液及尿液中 AD7c-NTP水平與癡呆的嚴重程度相關[3]。AD7c-NTP的過度表達可能介導了與 AD神經(jīng)退行性變化有關的細胞凋亡級聯(lián)反應,并通過這些反應進一步與磷酸化 Tau蛋白累積過程建立聯(lián)系。

本研究以中國中老年人為研究對象,對尿樣中AD7c-NTP含量進行了測定。結果表明 AD患者尿中 AD7c-NTP含量較智能正常人明顯升高,此結果與國外報道在一定程度上相符,提示在中國中老年人群中尿液 AD7c-NTP含量對 AD的診斷有重要意義,同時對 AD患者的病情評估有著較為樂觀的臨床參考價值,明確其相關性的原因有待于進一步深入研究。另外,本研究發(fā)現(xiàn),在以 22μg/ml為診斷界點的前提下,尿中 AD7c-NTP含量診斷 AD的敏感度為 89%,特異性為 90%,說明尿液 AD7c-NTP含量對 AD的診斷能夠同時保持較高的敏感度和特異性,這更加肯定了其在 AD診斷中的臨床參考價值。可見 AD7c-NTP對于 AD診斷是一項精確的生物標記,而且對老年人進行 AD風險的常規(guī)臨床評價同樣有幫助。本研究在對比各組尿中 AD7c-NTP含量與年齡及性別的關系中發(fā)現(xiàn),AD7c-NTP含量與性別和年齡無關。

血管性癡呆也是臨床比較常見的癡呆類型,近年來關于血管性癡呆與阿爾茨海默病是否為同一種疾病的研究越來越受到重視。本研究表明,血管性癡呆組尿液 AD7c-NTP含量明顯低于 AD組,差異有統(tǒng)計學意義,而與智能正常老年組相比較差異并無統(tǒng)計學意義,提示尿液 AD7c-NTP含量的增高與血管性癡呆的發(fā)病無明顯相關性.本研究在一定程度上證明二者不是同一種疾病,故可用于鑒別 AD和VD。

本研究所采用的標本為尿液,具有無創(chuàng)性易于被患者接受,同時采用直接酶聯(lián)免疫吸附測定方法具有準確性較高,可操作性強,方便,等優(yōu)點,使尿液AD7c-NTP含量檢測在 AD的診斷、鑒別診斷以及病情評估特別是早期診斷中有著重要的意義。

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