王 景

（解放軍第153醫(yī)院，河南鄭州 450007）

HPLC測(cè)定歸脾丸(濃縮丸)中黃芪甲苷的含量

王 景

（解放軍第153醫(yī)院，河南鄭州 450007）

目的：建立歸脾丸(濃縮丸)中黃芪甲苷含量的HPLC測(cè)定方法。方法：采用反相高效液相色譜法，使用Agilent HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-水（34∶66）作為流動(dòng)相。流速 1.0 ml/min，檢測(cè)波長 205 nm。結(jié)果：黃芪甲苷在12.5～100.0 μg/ml范圍內(nèi)線性較好（r=0.999 7），平均回收率為98.34%（RSD為0.41%）。結(jié)論：該方法快速、簡便、可靠、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，處方中其他成分對(duì)測(cè)定亦無干擾，分離效果好，可用于歸脾丸中黃芪甲苷含量測(cè)定。

歸脾丸；黃芪甲苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

歸脾丸(濃縮丸)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑(第七冊(cè))》，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：WS3-B-1303-93，由黨參、黃芪(蜜炙)、白術(shù)（炒）、甘草(蜜炙)、遠(yuǎn)志(制)、酸棗仁、當(dāng)歸、木香等 11 味藥組成，具有益氣健脾、養(yǎng)血安神之功效。用于心脾兩虛、氣短心悸、失眠多夢(mèng)、頭昏頭暈、肢倦乏力、食欲不振、崩漏便血。歸脾丸中黃芪來源于豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，性溫、味甘，為常用中藥，具有補(bǔ)氣固表、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌等功效[1]。黃芪總皂苷是黃芪的主要有效部位，黃芪甲苷作為總皂苷的主要活性指標(biāo)成分之一，常用作黃芪藥材及含黃芪復(fù)方制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[2]。歸脾丸制劑標(biāo)準(zhǔn)尚無含量測(cè)定項(xiàng)，為了提高藥品質(zhì)量，本文建立了高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定歸脾丸中黃芪甲苷含量的方法，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試劑

1.1 儀器

日本島津LC-2010C高效液相色譜儀。

1.2 試劑

黃芪甲苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110781-200613），歸脾丸（河南省宛西制藥股份有限公司，批號(hào)：090105，090405，090707）。乙腈為色譜醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20080102），水為純化水，其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Agilent HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（34∶66），流速為 1.0 ml/min，檢測(cè)波長為 205 nm，進(jìn)樣體積為20 μl，柱溫為室溫，理論板數(shù)不低于4000。

2.2 實(shí)驗(yàn)溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定黃芪甲苷對(duì)照品10 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇適量，振搖使溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 ml，置10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為50 μg/ml的黃芪甲苷。其作為對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品細(xì)粉約5 g，置索氏提取器中，加甲醇40 ml，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 ml，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀? ml使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)經(jīng)為1.5 cm，柱高為12 cm），以水50 ml洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 ml洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，備用[3]。

2.2.3 陰性供試品溶液的制備 取不含黃芪的空白制劑樣品，照2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，備用。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，供試品溶液，陰性供試品溶液各20 μl注入色譜儀記錄色譜圖，黃芪甲苷對(duì)照品峰位置無假陽性峰干擾，黃芪甲苷峰與其他峰分離完全，陰性供試品溶液在黃芪甲苷出峰位置無干擾。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系 取上述對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣5、10、20、15、40 μl，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（μg/ml）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：Y＝15903X+4660.7（r=0.9997）。 這表明黃芪甲苷在 12.5～100.0μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液20 μl，分別重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果黃芪甲苷峰面積的平均值為316840，其RSD為0.78%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)：090105），按供試品制備方法制備。于 0、4、8、12、16 h 進(jìn)樣分析，記錄峰面積，其 RSD 為0.81%，其結(jié)果表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(090105)的樣品5份，按供試品制備方法制備，測(cè)定含量，結(jié)果表明方法重復(fù)性較好。具體見表1。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

2.4.5 回收率試驗(yàn) 取本品（批號(hào)：090105）適量，共9份，約為2.5 g的80%、100%、120%，精密稱定，加入一定量的黃芪甲苷對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算回收率。測(cè)得黃芪甲苷平均加樣回收率(n=9)為99.71%，RSD=0.35%。結(jié)果表明，用高效液相法測(cè)定黃芪甲苷含量準(zhǔn)確度高。具體測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)（n=9）

2.4.6 含量測(cè)定 供試品溶液以2.2.2項(xiàng)下方法制備，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，在2.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，由峰面積值根據(jù)線性回歸方程計(jì)算含量(表3)。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 樣品提純方法的考察

本實(shí)驗(yàn)參考《中國藥典》2010版一部和有關(guān)文獻(xiàn)，確定以正丁醇萃取。氨試液洗滌正丁醇萃取液以除去提取液中色素、酸性成分的干擾，然后經(jīng)D101型大孔吸附樹脂柱，用70%乙醇洗脫，洗脫液蒸干，再用甲醇溶解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示方法學(xué)考察均符合要求。

3.2 檢測(cè)波長的確定

取2.2.1項(xiàng)下的溶液，在200～400 nm波長范圍掃描，結(jié)果在205 nm處有較大吸收，故選用205 nm波長處作為檢測(cè)波長。

3.3 檢測(cè)方法的選擇

已報(bào)道的黃芪甲苷的含量測(cè)定方法有：紫外分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法和熒光法[4]采用薄層掃描法、比色法檢測(cè)周期長，重現(xiàn)性差。近年來，文獻(xiàn)報(bào)道黃芪中黃芪甲苷含量采用HPLC-ELSD法測(cè)定，該法具有高效、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)，但該法計(jì)算繁瑣，影響因素多。本文采用HPLC法測(cè)定歸脾丸中黃芪甲苷的含量，操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，陰性無干擾，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:212-213.

[2]張金紅,周晶,吳志麗,等.HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪及金芪降糖片中黃芪甲苷的含量[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,16(1):26-29.

[3]國家藥典委員會(huì).中國藥典[M].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:284.

[4]蔣紅艷,楊元娟,何靜,等.黃芪及其制劑中黃芪甲苷定量分析方法研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥指南,2009,7(10）:209-211.

Determination of Astragaloside IV in Guipi pill(Concentrated Pills)by HPLC

WANG Jing
(153 Hospital of PLA,Henan Province,Zhengzhou 450007,China)

Objective:To establish a method for content determination of Astragaloside IV in Guipi pill(concentrated Pills)by HPLC.Methods:The experimental condition of the RP-HPLC method was as follows:Agilent HC-C18column(5μm，250×4.6mm)，with linear gradient elution using methanol and water （34∶66）;The flow rate was 1.0 ml/min;Detected wave length was 205 nm.Results:Astragaloside IV demonstrated good linear relationship in the range of 12.5～100 μg/ml （r=0.999 7）.The average recovery rate was 98.34%withRSDof 0.41%.Conclusion:The method is simple,reliable,accurate and It could be used in the determination of Astragaloside IV in Guipi pill.

Guipi pill;Astragaloside IV;HPLC;Determination

R943.1

B

1674-4721（2010）09（b）-046-02

2010-07-16)