張 亮, 楊 揚, 孫 越, 徐艷飛, 俞 琛,周 薇, 唐洪波, 李小方

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200062)

利用兩種方法篩選擬南芥uro突變體的回復(fù)子

張 亮, 楊 揚, 孫 越, 徐艷飛, 俞 琛,周 薇, 唐洪波, 李小方

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200062)

擬南芥URO基因與生長素的代謝密切相關(guān),為了深入了解URO基因的作用機制及其所參與的遺傳途徑,以擬南芥葉發(fā)育異常的半顯性突變體 uro(upright rosette)為材料,利用 EMS誘變和Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)這兩種方法篩選uro突變體的回復(fù)子.通過這兩種方法獲得了一些回復(fù)子,并對這些回復(fù)子進(jìn)行了驗證和初步分析,為今后的研究工作奠定了良好的基礎(chǔ).

擬南芥; URO; EMS誘變; Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)

Abstract:It was suggested that URO function might be associated w ith auxin-mediated p lant development.In o rder to know the role and the genetic net work of URO gene,supp resso rs(double mutants w ith supp ressed phenotype of uro mutant)were screened through EM Smutagenesis and Ac/Ds transposon system.Several supp ressors have been selected,validated and further analyzed.These supp ressors w ill p rovide important clew s fo r the function netwo rk of URO gene.

Key words:A rabidopsis; URO; EMSmutagenesis; Ac/Ds transposon system

0 引 言

擬南芥是十字花科擬南芥屬植物.近年來,擬南芥以其個體小、生長周期短以及基因組小等特點而成為分子遺傳學(xué)研究的模式植物.擬南芥的另一優(yōu)點是很容易被誘變,目前已從擬南芥中分離得到了幾千種突變體,這些突變體的獲得為揭示植物生長發(fā)育規(guī)律起了非常重要的作用[1].

uro(upright rosette意為垂直向上生長的蓮座葉),是本實驗室利用 T-DNA插入的方法得到的一個葉發(fā)育異常的半顯性突變體[2].由于在幼苗時期,它的蓮座葉生長方式表現(xiàn)為垂直向上(偏下性)生長,因此而得名.uro突變體表型有如下特點:頂端優(yōu)勢喪失、束間纖維發(fā)育異常、莖軟、側(cè)枝較野生型多等特征[3,4].對 uro突變體的前期研究表明:URO基因可能參與擬南芥的生長素信號系統(tǒng)對植物發(fā)育的調(diào)控過程;此外,uro突變體還具有一些乙烯相關(guān)表型,比如生長早期較短的下胚軸[5].以上這些研究結(jié)果充分表明了URO基因在植物生長發(fā)育方面的重要性,為了深入了解URO基因的作用機制及其所參與的遺傳途徑,弄清楚URO基因可能對生長素信號系統(tǒng)的調(diào)控作用,有必要通過篩選 uro突變體的回復(fù)子來尋找URO基因的互作基因,從而確定URO基因在整個基因網(wǎng)絡(luò)中的位置.

EM S誘變是實驗室比較常用的方法,EMS即甲基磺酸乙酯,是一類DNA烷化劑類誘變劑.這類烷化劑都帶有一個或多個活潑的烷基,這些烷基能夠加入堿基的許多位置,形成烷基化堿基,改變氫鍵的結(jié)合能力,從而造成基因突變;EM S化學(xué)誘變產(chǎn)生點突變的頻率較高,可以對作物的某一種特殊性狀進(jìn)行改良,易于突變體的篩選,價格便宜,操作簡單,不需要特殊設(shè)備,目前已成為應(yīng)用最廣泛、應(yīng)用效果最好的一種化學(xué)誘變劑.因此,首選 EM S誘變的方法篩選uro突變體的回復(fù)子.

Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)也被用來篩選突變體.Ds(dissociation)——轉(zhuǎn)座元件,它的存在可使染色體在近旁斷裂的機會大大增加,并因此改變鄰近基因的作用.Ds的改變又受另一控制因子Ac(activator)——編碼轉(zhuǎn)座酶基因的影響,Ac可位于基因組中的任何其他地方,它的存在可以使 Ds跳離原來的位置,插入到別的位置,從而影響植株的表型[6].首先,Ds元件是構(gòu)建在含有抗性基因和標(biāo)記基因(GUS)的T-DNA上[6],利用T-DNA插入創(chuàng)建突變體群體[7],此時,獲得的突變體再與Ac基因純合的野生型雜交,雜交植株的基因組內(nèi)就含有 Ac基因,而Ac基因的引入會使構(gòu)建到 T-DNA上的 Ds元件從 T-DNA上跳離,插入到基因組內(nèi)其他的位置,使植株的表型發(fā)生改變,因此可以利用Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)篩選回復(fù)子.因為uro突變體是 T-DNA插入突變體,而該 T-DNA上又具有 Ds元件,所以,可以利用 Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)來篩選uro突變體的回復(fù)子.

1 材料和方法

1.1 材料

擬南芥 uro(upright rosette,L er背景)突變體.

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的培養(yǎng)

植物材料種植在含有蛭石、黑土和珍珠巖 (比例為7∶2∶1)的混合機質(zhì)中,或者種植在1/2 MS(Murashige and Skoog不含糖)培養(yǎng)基上.植物種子消毒采用70%乙醇浸泡8 min,隨后用蒸餾水沖洗3次.種子經(jīng)過4℃低溫處理3 d后,置于24 h 23℃光照條件下培養(yǎng).

1.2.2 EM S誘變

稱種子0.2 g(約10 000顆)封于透水袋中,浸于0.15%吐溫中15 min,間或輕輕搖動使種子被充分浸潤.取裝有種子的小袋,置于15 mL重蒸水中,加15～45μL的 EM S原液至終濃度0.1%～0.3%(v/v)混勻.室溫下,于脫色搖床上避光8～12 h,取出裝有種子的小袋,以重蒸水洗滌種子一次,再將種子浸在10 mL重蒸水中2～4 h,或以清水緩緩沖洗2～4 h,將處理好的種子播種于土壤中.

1.2.3 Ac/uro純合植株的獲得

將含有純合 Ac基因的野生型L er(由 Prof M a Hong提供)與 uro雜交,獲得 F1代,F1代中URO基因和Ac基因都是雜合的,種植 F1代,單收 F2代,繼續(xù)種植 F2代,要單收 F2代中 uro表型植株的種子,繼續(xù)種植F3代,每個株系至少種植20棵,提取 F3代中全是 uro突變體表型株系的、至少16棵單株的DNA,用PCR的方法檢測是否有 Ac基因存在,如果所有單株中都有Ac存在,就說明該株系植株的 Ac基因是純合的,那么該株系的種子就是Ac/uro純合的植株.

1.2.4 PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction),簡稱 PCR.PCR程序:①94℃3 min,②94℃30 s,③56℃30 s(55℃30 s),④72℃30 s(72℃45 s),⑤30個循環(huán)從②到④,⑥72℃10 min.

2 結(jié)果和分析

2.1 回復(fù)子的篩選

uro突變體帶有頂端優(yōu)勢喪失,葉形較圓,莖、花序、花和果實等都有發(fā)育缺陷,幼苗時期子葉上豎等特征.針對 uro突變體的這些形態(tài)特征,確定以下篩選標(biāo)準(zhǔn),包括:頂端優(yōu)勢(較為)明顯,各器官發(fā)育正常,幼苗時期子葉發(fā)育正常等.

種子經(jīng)EM S處理后,其基因突變大部分只發(fā)生于同源染色體的一條上,對于隱性基因來說,在這一代(M 1)植物上觀察不到表型的變化,再加之 uro突變體是半顯性突變體,所以,必須將此代單收的種子(M 2)再播種下去,這樣才能獲得純合雙突變的植株.誘變 uro突變體的種子,單收得到1 000株M 1代,繼續(xù)種植M 1代,觀察M 2代表型分離情況.

利用Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)篩選回復(fù)子,首先要保證篩選庫的群體是Ac/uro純合的植株.在獲得這個篩選庫的過程中,選用PCR的方法來驗證uro表型植株的Ac基因是否純合,提取F3代中全是 uro表型株系中的,16棵單株的DNA,用PCR的方法驗證 Ac基因是否存在,如果所有單株中都有 Ac基因存在,就都有條帶擴(kuò)增出來,說明該株系植株的 Ac基因是純合的;而沒有Ac基因的野生型則沒有條帶擴(kuò)增出來.這樣就可以保證該株系是 Ac/uro純合植株.如圖1.

圖1 Ac基因純合驗證Fig.1 Identification of Ac homozygous gene

種植 Ac/uro純合植株,單收F1代的種子,F1代有可能是 uro突變體背景,而另外的不明突變位點雜合的植株,之后要再繼續(xù)種植單收的F1代,在F2代看到有表型的雙突變,從而獲得雙突變植株.

2.2 回復(fù)子的形態(tài)特征

利用以上兩種篩選策略,獲得了一些回復(fù)子.其中部分回復(fù)程度比較明顯,被重點研究.回復(fù)子1是通過 EM S誘變篩選得到的,它最典型的回復(fù)表型是側(cè)枝明顯減少,部分回復(fù)頂端優(yōu)勢.與 uro突變體相比,回復(fù)子1具有以下形態(tài)特征:(1)具有比較明顯的頂端優(yōu)勢,但還沒有回復(fù)到野生型的狀態(tài);(2)側(cè)枝顯著減少,uro突變體的側(cè)枝非常多;(3)葉片稍長且不平整,而 uro的葉片則呈圓形,且有葉裂;(4)果莢發(fā)育正常,較 uro大;(5)花瓣和野生型大小差不多,比 uro突變體大;(6)花發(fā)育正常,與 uro的花大小一樣;(7)種子發(fā)育正常,飽滿且顏色較 uro突變體淡,而 uro突變體的種子顏色較深,還有一些種子發(fā)育不飽滿.

引理3[12] 令是的一組基，如果存在{w1,w2,…,wnk}?使得〈vi,wj〉n=δij,i,j=1,2,…,nk,Gk=span{w1,w2,…,wnk} 也是Rk在中的一個補空間.

回復(fù)子2是通過Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)篩選得到的,其最典型的回復(fù)表型是具有野生型表型.與 uro突變體相比,回復(fù)子2具有以下形態(tài)特征:(1)具有明顯的頂端優(yōu)勢,幾乎回復(fù)到野生型的狀態(tài);(2)無側(cè)枝出現(xiàn),與野生型相同;(3)葉片比 uro突變體略大,較平整,呈圓形,uro突變體有葉裂;(4)果莢發(fā)育正常,比 uro突變體的長;(5)花瓣比 uro突變體和野生型的都大;(6)花比 uro突變體和野生型的都大;(7)種子發(fā)育正常,飽滿且顏色較 uro突變體深,而uro突變體的種子顏色較淺,有些種子發(fā)育也不飽滿.

回復(fù)子1和2的表型具體見圖2,表1.2.3 回復(fù)子uro突變體背景驗證

在篩選過程中,有時會遇到偶然飄落到種植盆中的其他來源的種子,其表型大部分近似于野生型,很可能會被當(dāng)成回復(fù)子收獲.為避免這種情況發(fā)生,結(jié)合 uro突變體的特點,用PCR的方法來鑒定,確保該回復(fù)子是從 uro突變體的背景下獲得的.

uro突變體是由 T-DNA插入URO基因的啟動子區(qū)造成的,通過設(shè)計兩套引物進(jìn)行PCR反應(yīng)來驗證回復(fù)子的 uro突變體背景.首先,在位于URO基因的啟動子區(qū),靠近 TDNA右臂,遠(yuǎn)離URO基因的編碼區(qū)設(shè)計引物P1;在 T-DNA左臂上,鄰近URO基因的編碼區(qū)的位置設(shè)計引物P2,在位于URO基因的編碼區(qū)終止部位設(shè)計引物P3.如圖3.

首先,以回復(fù)子基因組DNA為模版,用P2與 P3為引物進(jìn)行PCR,若有陽性條帶則說明該植物中含有插在URO基因上游的T-DNA,若沒有陽性條帶則說明該植物就是野生型背景;其次,以回復(fù)子基因組DNA為模版,用引物 P1與 P3進(jìn)行 PCR,如果有陽性條帶,則證明該植物至少有一條染色體具有野生型背景,沒有陽性條帶則說明P1與P3之間有 TDNA插入;只有當(dāng)用P2與P3得到陽性條帶,而P1與P3沒有陽性條帶時,該植物才是 uro突變體背景的.

分別提取回復(fù)子1和2的DNA,作為模板,用引物P1,P2分別和 P3配對進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示,P1和P3配對擴(kuò)增不出條帶,而 P2和 P3配對擴(kuò)增出條帶,回復(fù)子1和2的PCR結(jié)果和陽性對照uro的PCR結(jié)果一致,如圖4,證明回復(fù)子1和2都是uro突變體背景的.

3 討 論

本實驗用擬南芥 uro突變體為材料,用EM S誘變和 Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)這兩種方法篩選uro突變體的回復(fù)子.結(jié)果表明,這兩種方法都是有效可行的,但各有優(yōu)缺點.

圖2 回復(fù)子的形態(tài)特征Fig.2 The pheno type of supp resso rs

注: (a)L er(左1),uro(左2),回復(fù)子1(右2)和回復(fù)子2(右1)的整體形態(tài)特征,Bar=1 cm;

(b)L er(左1),uro(左2),回復(fù)子1(右2)和回復(fù)子2(右1)的葉子,Bar=2.5 mm;

(c)L er(左1),uro(左2),回復(fù)子1(右2)和回復(fù)子2(右1)的果莢,Bar=2 mm;

(d)L er(左1),uro(左2),回復(fù)子1(右2)和回復(fù)子2(右1)的花瓣,Bar=0.5 mm;

(e)L er(左1),uro(左2),回復(fù)子1(右2)和回復(fù)子2(右1)的花序,Bar=1 mm;

(f)L er(左1),uro(左2),回復(fù)子1(右2)和回復(fù)子2(右1)的種子,Bar=0.5 mm;

(g)L er(左1),uro(左2),回復(fù)子1(右2)和回復(fù)子2(右1)花,Bar=0.75 mm

表1 回復(fù)子的形態(tài)特征Tab.1 The pheno type of supp resso rs

圖3 引物位置Fig.3 The location of the p rimers

圖4 uro突變體背景鑒定Fig.4 Identification of uro background

Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng):前期準(zhǔn)備工作時間長,在獲得 Ac/uro純合的植株后,也要種植兩代才能獲得有表型的雙突變.雙突變植株與其相應(yīng)背景的野生生態(tài)型雜交,后代表型分離獲得單突變.利用TA IL-PCR和圖位克隆這兩種方法都可以克隆相關(guān)的突變基因.獲得 Ac/uro純合植株的篩選庫之后,在種植的過程中,除了找有表型的雙突變以外,還要單收每一代uro表型植株的種子,作為后續(xù)的篩選庫.這樣,就會有更多的后備篩選植株.

針對本實驗,利用Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的方法篩選uro突變體的回復(fù)子要更好一些.因為 uro就是 T-DNA插入獲得的突變體,而且該 T-DNA上還具有Ds元件,完全符合篩選條件,而且利用TA IL-PCR的方法可以在短時間內(nèi)克隆到相關(guān)突變基因.如果是單純的誘變野生型獲得突變體的話,EM S誘變是最佳之選.

在實驗過程中,利用PCR的方法驗證Ac基因是否純合和回復(fù)子是否是uro突變體背景,從分子角度證明篩選得到的回復(fù)子的真實可靠性,不用通過費時的遺傳分析來證明,大大節(jié)省了實驗時間和人力資源.

現(xiàn)在獲得突變體的方法有很多,但是應(yīng)用最多的就是 T-DNA插入.T-DNA具備以下優(yōu)點:可裝載大到50 kb的外源DNA;可隨機地整合且在表達(dá)活躍區(qū)域的整合幾率較高[8];其整合不引起植物基因組大的重排[9];對特定的基因類別沒有明顯的插入偏向性[10],因此,在植物基因工程和基因克隆中被廣泛應(yīng)用.如果在構(gòu)建 T-DNA的同時,在 T-DNA上插入Ds元件的話,對今后利用 Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)篩選回復(fù)子是很有利的,而且只要發(fā)現(xiàn)某個突變性狀與插入的 T-DNA共分離,就很容易分離出 T-DNA側(cè)翼的基因組序列,為今后的基因克隆節(jié)省了大量時間.

利用以上兩種方法,篩選到一些uro突變體的回復(fù)子,這些回復(fù)子可育并穩(wěn)定遺傳.值得注意的是,這些回復(fù)子的表型不盡相同,表型回復(fù)的程度也不一樣,暗示URO基因的下游包括了比較復(fù)雜、多元的信號因素,不同的回復(fù)子可能代表了該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的不同分支.為今后研究URO基因的作用機制及其所參與的遺傳途徑,弄清楚URO基因可能對生長素信號系統(tǒng)的調(diào)控作用,確定URO基因在整個基因網(wǎng)絡(luò)中的位置奠定了良好的基礎(chǔ).

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Screen ing the suppressors of uro by EMSmutagenesis and Ac/Ds transposon system

ZHANG Liang, YANG Yang, SUN Yue, XU Yan-fei, YU Chen,ZHOU Wei, TANG Hong-bo, L IXiao-fang

(School of L ife Science,East China N ormal University,Shanghai 200062,China)

Q948

A

1000-5641(2010)04-0085-07

2009-04

863項目(2006AA10Z109);國家自然科學(xué)基金面上項目(30570159)

張亮,女,碩士研究生.E-mail:zhangliang@shsm u.edu.cn.

孫越,女,副教授,研究方向為植物發(fā)育與分子生物學(xué).E-mail:ysun@bio.ecnu.edu.cn.