杜軍偉,王遠(yuǎn)志,陳創(chuàng)夫,葛陽(yáng)春,唐利燕

2.新疆民族與地方高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)siRNA對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞中FTH1基因表達(dá)的抑制作用*

杜軍偉1,2,王遠(yuǎn)志2,陳創(chuàng)夫2,葛陽(yáng)春1,2,唐利燕1,2

目的通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)基因表達(dá)的mRNA,建立一種直接觀察小干擾RNA(siRNA)抑制目的基因表達(dá)的方法。方法化學(xué)設(shè)計(jì)合成對(duì)應(yīng)于FT H1(ferritin heavy chain 1,FTH1)基因表達(dá)mRNA的siRNA,經(jīng)TurboFectTMin vitro Transfection Reagent轉(zhuǎn)染小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞,48h后,提取總 RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以 3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參,定量檢測(cè)FTH1的表達(dá),比較干擾前后FT H1基因mRNA的量。結(jié)果3種siRNA處理的小鼠巨噬細(xì)胞中FT H1基因的表達(dá)抑制率最高為97.60%。結(jié)論實(shí)時(shí)定量PCR方法的建立為研究布魯氏菌在侵染巨噬細(xì)胞過(guò)程中FTH1的功能提供了有效途徑。

實(shí)時(shí)定量PCR;siRNA;小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞;FT H1

2.新疆民族與地方高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003

布魯氏菌病是嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的動(dòng)物源性傳染性疾病,主要感染反芻動(dòng)物和人類〔1〕。其病原為布魯氏菌(Brucella),是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的致病菌,人感染后常表現(xiàn)為持續(xù)性感染,可引發(fā)生殖系統(tǒng)損傷、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎等,甚至?xí)适趧?dòng)能力〔2〕。家畜感染后造成流產(chǎn)、空懷等〔3〕,給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。巨噬細(xì)胞是布魯氏菌生存和繁殖的靶細(xì)胞。IV型分泌系統(tǒng)(VirB)是布魯氏菌毒力基因,與布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)生存、復(fù)制有關(guān)。VirB區(qū)段包括 12個(gè)基因,形成一個(gè)操縱子。VirB系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能研究顯示:VirB2和VirB5位于細(xì)菌表面,形成菌毛樣結(jié)構(gòu)〔4-5〕。王遠(yuǎn)志等〔6〕運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)從綿羊種布魯氏菌019株侵染綿羊巨噬細(xì)胞的cDNA文庫(kù)中成功的篩選出鐵蛋白重鏈多肽(ferritin heavy chain 1,FT H1)與布魯氏菌019株VirB5相互作用,但是FTH1在布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞中的作用機(jī)制仍不清楚,本試驗(yàn)通過(guò)運(yùn)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)FTH1的表達(dá),并運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量技術(shù)來(lái)檢測(cè)干擾后FT H1基因mRNA的表達(dá)量。從而為下一步檢測(cè)FTH1在布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù);宿主菌 DH5a由本實(shí)驗(yàn)室保存;RNAi表達(dá)載體RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen Vector試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience Clontech公司;限制性內(nèi)切酶MUL-I、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購(gòu)自大連生物工程有限公司;DMEM培養(yǎng)基、小牛血清購(gòu)自GIBCO公司;TurboFectTMin vitro T ransfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol購(gòu)自Invitrogen公司;熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自博奧公司;無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。LSM510激光共聚焦顯微鏡:新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;Smart CyclerⅡ?qū)崟r(shí)定量PCR儀:Cepheid公司。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)FT H1的siRNA的設(shè)計(jì) 將小鼠FTH1基因(GenBank,No:NM_010239)提交到Ambion公司的 shRNA查找網(wǎng)站(http://www.ambion.com/techlib/misc/shRNA_finder.html),針對(duì)FTH1基因分別確定了3對(duì)陽(yáng)性siRNA片段,1對(duì)與其它物種基因序列均無(wú)同源性的陰性對(duì)照序列,合成的siRNA對(duì)應(yīng)的DNA序列如表1。

表1 合成shRNA對(duì)應(yīng)DNA序列Tab.1 Synthesized DNA Sequence corelated to siRNA

1.2.2 RNA干擾FT H1基因的綠色熒光蛋白表達(dá)載體pSIREN-siRNA的構(gòu)建 按照RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen Vector試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,將合成的 siRNA正反義鏈 DNA片段稀釋到100 μ mol/L;按照摩爾比 1∶1 混合后,95℃ 30 s,72℃2 min,37℃2 min,25℃2 min,PCR儀上合成雙鏈;稀釋至 0.5 μ mol/L后,進(jìn)行與 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen Vector的連接,分別命名為pSIREN-A/B/C/D;挑取陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序,將鑒定正確的克隆菌,按照無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(天根生化科技有限公司)說(shuō)明書(shū)大量制備質(zhì)粒,-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 轉(zhuǎn)染 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7用含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基(100U青霉素/mL、100U鏈霉素/mL),將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞置于12孔細(xì)胞板中,在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后,用 TurboFectTMin vitro Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,試驗(yàn)將pSIREN-D轉(zhuǎn)染組設(shè)為陰性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后5%CO2,37℃條件下培養(yǎng)48 h,用LSM510激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中的綠色熒光表達(dá)蛋白。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR引物設(shè)計(jì) 用Pimer 3.0軟件分別針對(duì)目標(biāo)基因FT H1、內(nèi)參基因GAPDH設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物,引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列Tab.2 Primers sequence

1.2.5 pSIREN-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞對(duì)FTH1基因表達(dá)的作用 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)入干擾質(zhì)粒后細(xì)胞中FTH1的拷貝數(shù),將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 RNA干擾FTH1基因的綠色熒光表達(dá)載體pSIREN-siRNA的構(gòu)建結(jié)果 經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序,結(jié)果表明所插入的干擾片段分別與FTH1-A/B/C/D序列比對(duì)完全正確。2.2 pSIREN-siRNA質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)熒光觀察 運(yùn)用TurboFectTMin vitro Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染,在48h后用LSM510激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞中的綠色熒光表達(dá)蛋白,經(jīng)多處采集信息計(jì)算出質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率約等于100%,見(jiàn)圖1。

圖1 RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSIREN-siRNA表達(dá)質(zhì)粒48h后的熒光照片1.1:48h;1.2:對(duì)照Fig.1 The fluorescence of RAW264.7 cells transfected with pSIREN-siRNA expression plasmids1.1:48 h;1.2:control cells.

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=-0.22x+12.087,曲線的斜率為-0.22,相關(guān)系數(shù)為0.996,擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線有一個(gè)主峰值,如圖2。

FTH1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=-0.266x+13.163,曲線的斜率為-0.266,相關(guān)系數(shù)為0.983,擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線有一個(gè)主峰值,如圖3。

2.4 pSIREN-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后干擾效果檢測(cè) 以pSIREN-A/pSIREN-B/pSIREN-C/p-SIREN-D四個(gè)siRNA,分別對(duì)FTH1基因進(jìn)行干擾(48h),實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)干擾前后FTH1基因在細(xì)胞中的拷貝數(shù),以相應(yīng)的FTH1基因檢測(cè)值/GAPDH的檢測(cè)值作為校正值,再用公式干擾效率(%)=(RNAi陰性對(duì)照組-RNAi試驗(yàn)組)/RNAi陰性對(duì)照組×100%進(jìn)行各個(gè)pSIREN-siRNA質(zhì)粒干擾效果的檢測(cè)比較。結(jié)果表明FTH1基因的3個(gè)試驗(yàn)組的siRNA干擾質(zhì)粒都具有干擾效果pSIREN-A為57.60%,pSIREN-B為88.50%,pSIREN-C為97.60%。

3 討 論

布魯氏菌是細(xì)胞內(nèi)寄生菌,Tsuji等〔7-8〕證實(shí)鐵蛋白重鏈轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游有抗氧化反應(yīng)元件,可對(duì)氧化反應(yīng)做出應(yīng)答,保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。大量證據(jù)表明致病菌的致病力與其攝取鐵的能力直接相關(guān)〔9〕,有效的鐵攝取被看作是重要的致病因素,致病菌必須通過(guò)高度特異、有效的鐵攝取系統(tǒng)完成鐵的攝入〔10-11〕。

由于布魯氏菌VirB5可以和巨噬細(xì)胞中的FTH1相互作用,我們可以推測(cè),FTH1與VirB5結(jié)合,誘導(dǎo)布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)將螯合的鐵離子輸入菌體內(nèi),提供細(xì)菌所需的鐵,從而維持了細(xì)菌的毒力;另一方面,感染細(xì)胞中的FTH1攝取了胞漿內(nèi)的游離鐵,減少了二價(jià)鐵離子對(duì)細(xì)胞的損傷,起到抗氧化作用,延緩了細(xì)胞的凋亡,從而使布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期生存。在本試驗(yàn)中,針對(duì)FT H1設(shè)計(jì)干擾質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染RAW264.7巨噬細(xì)胞,在48h后用LSM510激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞中的綠色熒光表達(dá)蛋白,經(jīng)多處采集信息,質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率接近于100%。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),siRNA干擾質(zhì)粒pSIREN-C對(duì)FTH1基因表達(dá)的抑制率最高達(dá)到了 97.60%,具有較好的沉默效率,能高效、靶向性降低FT H1基因的表達(dá)。通過(guò)這一結(jié)果,我們可以推測(cè):FT H1基因的表達(dá)降低可能會(huì)削弱胞內(nèi)布魯氏菌的毒力,并造成巨噬細(xì)胞中的游離鐵離子增多,細(xì)胞抗氧化能力減弱,避免了布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期寄生。通過(guò)本試驗(yàn)為研究新型的藥物來(lái)控制布魯氏菌,對(duì)巨噬細(xì)胞的入侵以及為研究布魯氏菌胞內(nèi)寄生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

〔1〕Pappas G,Papadimitriou P,Akritidis N,et al.T he new g lobal map of human brucellosis〔J〕 .Lancet Infect Dis 2006,6:91-99.

〔2〕 Delrue RM,M artinez-Lorenzo M,Lestrate P,et al.Identification ofBrucellaspp.genes involved in intracellular trafficking〔J〕.Cell Microbiol,2001,3:487-497.

〔3〕尚德秋.中國(guó)布魯氏菌病防治科研 50年〔J〕.中華流行病學(xué)雜志,2000,21(1):55-57.

〔4〕 Christie PJ,Vogel JP.Bacterial ty pe IV secretion:conjugati-on systems adapted to delier effectormolecules to host cells〔J〕.T rends Microbiol,2000,8:354-360.

〔5〕 Lai EM,Kado CI.T he T-pilus of Agrobacterium tumefacie-ns〔J〕.T rends Microbiol,2000,8:361-369.

〔6〕王遠(yuǎn)志.綿羊種布魯氏菌致病的分子機(jī)制研究〔D〕.石河子大學(xué),動(dòng)物科技學(xué)院.2008.

〔7〕Tsuji Y,Moran E,T orti SV,et al.Transcriptional regulation of the mouse ferritin H gene.Involvement of p300/CBP adaptor proteins in FER-1 enhancer activity〔J〕.J Biol Chen,1999,274(11):7 501.

〔8〕T suji Y.JunD Activates transcription of the human ferritin H gene through an antiocidant response element during oxidative stress〔J〕.Oncogene,2005,24(51):7 567.

〔9〕Basaraba RJ,Bielefeldt-Ohmann H,Eschelbach EK,et al.Increased expression of host iron-binding proteins precedes iron accumulation and calcification of primary lung lesions in experimental tuberculosis in the guinea pig〔J〕.Tuberculosis,2008,88(1):69-79.

〔10〕Rossi M S,Fetherston FD,Letoffe S,et al.Identification and characterization of the hemophore-dependent beme acquisition system ofYersinia pestis〔 J〕.InfectImmun,2001,69:6707-6017.

〔11〕 Braun V,Braun M.Active transport iron and siderophore antibiotics〔J〕.Curr Opin Microbiol,2002,5:194-201.

Detection of inhibitory effect of siRNA on FTH1 gene expression of mouse RAW264.7 macrophages with rea1-time PCR

DU Jun-wei1,2,WANG Yuan-zhi2,CHEN Chuang-fu2,GE Yang-chun1,2,TANG Li-yan1,2

(1.College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi832003,China;
2.Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease,Shihezi832003,China)

The aim of the present study was to establish an assay of real-time PCR to detect the inhibitory effect of siRNA on gene expression.The chemically synthesized siRNAs matched with ferritin heavy chain 1(FTH1)mRNA were transfected into RAW264.7 macrophages with TurboFectTMin vitroTransfection Reagent.Then the total RNA was extracted from the cells and reversely transcribed into cDNA.The expression of FTH1 was quantified and compared by real-time PCR on the basis of expressions of g1yceraJdehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)as internal control in different groups.Three kinds of siRNAs could significantly inhibited FT H1 mRNA expression in mice RAW264.7 macrophages and the inhibition rate reached to 97.60%.Results demonstrated that the built real-time PCR could be employed in detection of FTH1,which provides a method to study FTH1 function in the course ofBrucellainfection.

real-time PCR;siRNA;mice RAW264.7 macrophage;FTH1

R378.5

A

1002-2694(2010)07-0638-04

*國(guó)家自然科學(xué)基金(30800813),兵團(tuán)博士基金(2009JC15),高層次人才科研啟動(dòng)資金專項(xiàng)(RCZX200828)和973項(xiàng)目(2010CB530200)聯(lián)合資助

王遠(yuǎn)志,Email:wangyuanzhi621@126.com

陳創(chuàng)夫,Email:ccf-xb@163.com

1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子 832003;

2009-11-10;

2010-03-22