范世珍,劉牧軍,羅光亮,孫海峰

(1.深圳市福田區(qū)中醫(yī)院 檢驗科,廣東 深圳 518034;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 放射線科,吉林長春 130041)

多重PCR檢測急性反復(fù)上呼吸道感染兒童病毒和非典型細菌

范世珍1,劉牧軍1,羅光亮1,孫海峰2*

(1.深圳市福田區(qū)中醫(yī)院 檢驗科,廣東 深圳 518034;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 放射線科,吉林長春 130041)

*通訊作者

急性反復(fù)上呼吸道感染是住院兒童中最常見的疾病。有報道其發(fā)病率占所有兒科住院病人的38%,5歲內(nèi)兒童的63%[1]。引起急性反復(fù)上呼吸道感染以細菌和病毒最常見。目前診斷病毒感染的常見方法是取鼻咽抽吸物進行免疫熒光試驗[2],該方法能診斷數(shù)種病原體,如A、B型流感病毒,1、2、3型副流感病毒,呼吸道合胞病毒以及腺病毒等。但此方法檢出率低,僅20%左右。另一種方法是分離培養(yǎng),缺點是耗時,對于難培養(yǎng)的病毒顯得無能為力。自從流感病毒H1N1爆發(fā)以來,一種快速、高敏感性的診斷方法顯得非常迫切。

多重PCR(multiplex PCR)能在同一反應(yīng)試管內(nèi)同時檢出多種病原體,能為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息[3,4]。本研究通過運用多重PCR對186例急性反復(fù)上呼吸道感染兒童標(biāo)本中病毒及非典型細菌進行了檢測,報道如下。

1 材料和方法

1.1 病人的選擇

本研究的186例急性反復(fù)上呼吸道感染的兒童均為2007年4月-2009年3月我院兒科的住院患者,年齡均不超過12歲。研究過程中均與兒童父母簽署知情同意書。急性反復(fù)上呼吸道感染按1987年成都會議診斷標(biāo)準(zhǔn),即0-2歲上感次數(shù)7次/年,5-6歲 6次/年,6-12歲 5次/年以上;突然發(fā)病(＜36 h),并至少有以下1項癥狀或體征:咳嗽,咽喉疼痛,耳痛,聲音嘶啞,喘鳴/哮鳴音,呼吸困難或伴發(fā)熱。

1.2 cDNA合成與多重PCR

無菌條件下獲取病人雙份標(biāo)本(鼻咽抽吸物,鼻咽拭子)用于核酸提取。用于標(biāo)本中病原體RNA或DNA的試劑盒購自Qiagen公司。模板提取按照試劑盒的說明進行。合成的cDNA儲存于-20℃用于多重PCR分析。本實驗共采用5組套式PCR引物用于檢測20種呼吸道病毒和非典型性細菌。第1組引物用于擴增A、B流感病毒和H1、H3、H5亞型。第2組引物用于擴增 1、2、3、4型副流感病毒。第 3組引物用于A、B型呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腸道病毒的檢測。第4組引物用于擴增冠狀病毒OC43,229E,SARS-CoV,以及變性肺病毒。第5組引物包括肺炎支原體、肺炎嗜衣原體,嗜肺軍團菌,腺病毒。擴增條件按照參考文獻提供的方法進行[2]。本實驗用的PCR儀為Eppendorf公司梯度PCR儀。

2 結(jié)果

本研究當(dāng)中,共檢測出81例患者至少有1種病原體陽性(44%,81/186),其中鼻咽抽吸物中檢測出78例(41.9%,78/186),略高于鼻咽拭子(38.2%,71/186),經(jīng)χ2檢驗兩者無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

所有81例陽性患者檢測出的病原體中,以流感病毒,副流感病毒,呼吸道合胞病毒,肺炎支原體最常見,占70.4%(57/81)。其中1種病原體感染67例(占82.7%),13例患者存在2種病原體感染,包括:2例患者變性肺病毒合并肺炎支原體感染,2例患者腺病毒合并肺炎嗜衣原體感染,2例患者肺炎支原體合并肺炎嗜衣原體感染。1例患者同時伴有呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肺炎嗜衣原體感染。在所有混合感染兒童中,肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、腺病毒是混合感染中最常見的病原體。在本研究中尚未檢測出冠狀病毒如SARS等,見表1。

表1 81例陽性病例的病原體感染情況

3 討論

PCR技術(shù)因其快速、簡便、特異且敏感,因此在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。特別是難以培養(yǎng)的病原體,如肺炎嗜衣原體、肺炎支原體等,PCR技術(shù)也許是唯一可行的方法[5]。PCR技術(shù)根據(jù)檢測的通量,可分為普通PCR(單一PCR)和多重PCR。普通PCR僅應(yīng)用一對引物,通過PCR擴增產(chǎn)生一個核酸片段,主要用于單一病原體的鑒定。但在臨床上,如急性反復(fù)上呼吸道感染,通常是由多種病原菌引起的混合感染,因此快速診斷并鑒定病原體的類型,對正確使用抗生素以及防止疾病的傳播具有重要意義。

在本研究中采用多重PCR從186例急性反復(fù)上呼吸道感染兒童中檢測出20余種呼吸道病毒和非典型細菌,共檢測出81例,檢出率達44%,與國內(nèi)外報道接近[1]。盡管從本研究選取的樣本來看,鼻咽抽吸物略高于鼻咽拭子,但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析兩種不同的取材方法的檢出率無明顯差別。從檢測出的病原體來看,病毒最常見,而平時難以培養(yǎng)的肺炎支原體、肺炎嗜衣原體,在本研究過程中也具有一定的陽性率,但在許多患者中表現(xiàn)為混合感染。

與單一PCR相比,多重PCR的另一優(yōu)勢是能大大縮短每種病原體單一PCR的檢測時間。通常情況下,單一PCR的反應(yīng)時間為35 min-3 h,而多重PCR能在1d內(nèi)同時完成近20種病原體的檢測[5]。因此從某種意義上講,能減輕患者及家屬的焦慮情緒,減少其住院時間。盡管多重PCR具有很多優(yōu)勢,但其敏感性和特異性通常情況下略遜于單一PCR,且費用較后者高[6],又只在醫(yī)院或?qū)I(yè)的實驗室開展,這可能是限制其廣泛應(yīng)用于臨床的重要原因。

總之,本研究通過多重PCR對急性呼吸道感染兒童病原體的檢測,為流行病學(xué)研究提供了新的方法。當(dāng)然,要診斷某病原體感染,單純靠一個多重PCR的陽性結(jié)果不能完全說明問題,還需要其他診斷方法的補充。迄今為止,多重PCR方法難以在臨床廣泛開展,但近年來突發(fā)性疾病的廣泛流行,如2003年SARS及2009年流感病毒H1N1的爆發(fā),這給疾病的監(jiān)測帶來了新的挑戰(zhàn),因此深入探索快速、高通量的檢測方法勢在必行。

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1007-4287(2010)06-0890-02

2009-05-29)